劉柳　蔣超　王舒陽

[摘要]目的探討敲低長鏈非編碼RNA`-結腸癌相關轉錄因子1（IncRNA`-CCAT1）表達對膠質瘤細胞活力、凋亡的影響及機制。方法將人腦膠質瘤U251細胞隨機分為空白組（未轉染的細胞）、陰性對照IncRNA`-CCAT1`-NC組（NC組）和IncRNA`-CCAT1`-小干擾RNA（siRNA）組（CCAT1`-siRNA組），CCAT1`-siRNA轉染U251細胞48 h，應用實時熒光定量PCR（qRT`-PCR）、流式細胞術及Western blotting分別檢測轉染效果、細胞凋亡率及β`-catenin、cyclinD1和Survivin蛋白表達。采用MTT法檢測CCAT1`-siRNA轉染U251細胞24～96 h的細胞活力。結果CCAT1`-siRNA組和空白組間CCAT1 mRNA表達差異具有統(tǒng)計學意義（F=472.885，P<0.05），而NC組和空白組間CCAT1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。CCAT1`-siRNA組和空白組相比較，細胞活力降低，凋亡率升高，β`-catenin、cyclinD1和Survivin蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義（F=13.372～100.869，P<0.05）。結論敲低IncRNA`-CCAT1表達可抑制膠質瘤細胞活力、誘導凋亡，其機制可能與下調Wnt/β`-catenin信號通路β`-catenin、cyclinD1和Survivin表達有關。

[關鍵詞]神經膠質瘤;RNA，長鏈非編碼;結腸癌相關轉錄因子1;細胞凋亡;Wnt信號通路

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of knockdown of the long non`-coding RNA colon cancer`-associated transcript 1 （lncRNA`-CCAT1） on the viability and apoptosis of glioma cells and related mechanism. MethodsHuman glioma U251 cells were randomly divided into blank group （untransfected cells）， lncRNA`-CCAT1 negative control group （NC group）， and lncRNA`-CCAT1 small interfering RNA group （CCAT1`-siRNA group）. U251 cells were transfected with CCAT1`-siRNA for 48 h. Quantitative real`-time PCR was used to measure transfection efficiency， flow cytometry was used to measure cell apoptosis rate， and Western blot was used to measure the protein expression of β`-catenin， cyclinD1， and Survivin. MTT assay was used to measure the viability of U251 cells at 24-96 h of CCAT1`-siRNA transfection. ResultsThere was a significant difference in the mRNA expression of CCAT1 between the CCAT1`-siRNA group and the blank group （F=472.885，P<0.05）， while there was no significant difference between the NC group and the blank group （P>0.05）. Compared with the blank group， the CCAT1`-siRNA group had a significant reduction in cell viability， a significant increase in apoptosis rate， and significant reductions in the protein expression of β`-catenin， cyclinD1， and Survivin （F=13.372-100.869，P<0.05）. ConclusionLncRNA`-CCAT1 knockdown can inhi`-bit the viability and induce apoptosis of glioma cells， possibly by downregulating the expression of β`-catenin， cyclinD1， and Survivin in the Wnt/β`-catenin signaling pathway.

[KEY WORDS]glioma; RNA， long noncoding; colon cancer associated transcription 1; apoptosis;?Wnt signaling pathway

腦膠質瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、死亡率高及治愈率低的特點，嚴重危害人民的生命健康[1]。隨著分子生物學及腫瘤基因學的發(fā)展，膠質瘤的基因治療成為研究熱點。長鏈非編碼RNA（IncRNA）是一類不編碼蛋白、轉錄后長度大于200 nt的RNA分子，具有類似mRNA樣結構。近些年大量研究結果表明，IncRNA與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關[2`-3]。結腸癌相關轉錄因子1（CCAT1）是新近發(fā)現的一種IncRNA，在肝癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤中IncRNA`-CCAT1均呈現高表達，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[4`-6]。膠質瘤相關研究結果顯示，IncRNA`-CCAT1可促進膠質瘤細胞增殖、侵襲、遷移和上皮細胞`-間充質轉化（EMT）[7`-8]。但關于其對膠質瘤細胞凋亡的影響及機制目前尚未清楚。因此，本研究以人腦膠質瘤U251細胞為研究對象，通過RNA干擾技術抑制CCAT1表達，旨在探討敲減IncRNA`-CCAT1表達對腦膠質瘤細胞凋亡影響，并進一步研究影響凋亡的作用機制?，F將結果報告如下。

1材料和方法

1.1細胞系及試劑和儀器

人腦膠質瘤U251細胞系購自中國科學院上海細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)液、FBS均購自美國Gibco;IncRNA`-CCAT1`-陰性對照（NC）和IncRNA`-CCAT1`-小干擾RNA（siRNA）均由廣州瑞博生物科技有限公司合成;噻唑藍（MTT）試劑盒及DMSO均購自美國Sigma;β`-catenin、cyclinD1和Survivin抗體及HRP標記的二抗均購自美國Abcam;細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD;多功能酶標儀購自美國Bio`-Rad;實時熒光定量PCR（qRT`-PCR）試劑盒購自大連TaKaRa。

1.2細胞培養(yǎng)

U251細胞常規(guī)復蘇后，使用含體積分數0.10 FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在體積分數0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞生長狀態(tài)，每2 d換液1次，細胞生長狀態(tài)良好，且達90%～95%融合時，按照實驗需要傳代。取生長至對數期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3分組及轉染

將U251細胞隨機分為空白組（未轉染的細胞，A組）、陰性對照IncRNA`-CCAT1`-NC組（NC組，B組）和IncRNA`-CCAT1`-siRNA組（CCAT1`-siRNA組，C組）。轉染的操作步驟按照LipofectamineTM 2000說明進行。轉染前1 d以生長至對數期的U251細胞接種于6孔板，密度為（3～5）×107/L，使轉染前細胞達30%～50%融合。制備脂質體和siRNA復合物，將復合物加入6孔板，于體積分數0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗研究。

1.4qRT`-PCR方法驗證敲低U251細胞IncRNA`-CCAT1效率

采用Trizol法提取轉染CCAT1`-siRNA 48 h細胞總RNA，紫外線分光光度計檢測A260/280比值及濃度，比值為1.8～2.0時，表明樣品純度高，可用于后續(xù)實驗。依據大連TaKaRa逆轉錄試劑盒說明要求將總RNA逆轉錄為cDNA。參照qRT`-PCR試劑盒說明配置反應體系及設置反應條件，其中反應體系為20 μL，反應結束后，依據所得Ct均值，以GAPDH作為內參，采用2-△△Ct方法計算各組細胞IncRNA`-CCAT1的mRNA相對表達量。每組實驗均重復3次，取均值。

1.5MTT法測定細胞活力

以每孔5 000個生長至對數期的U251細胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照1.3方法轉染，每組設置5個重復孔，轉染后的細胞在體積分數0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72和96 h，吸去孔內培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L），常規(guī)孵育4～6 h，吸盡孔內上清，每孔加DMSO 150 μL，搖床低速震蕩10 min。于490 nm波長處用酶標儀測定各孔的吸光度（A）值。實驗重復3次，取均值。

1.6流式細胞術測定細胞凋亡率

以每孔5×105個生長至對數期的U251細胞接種于96孔板，參照1.3方法將CCAT1`-siRNA轉染細胞，預冷PBS洗滌、1×binding buffer重懸轉染48 h的細胞，取200 μL細胞懸液，分別加5 μL 的Annexin V`-FITC和5 μL的 PI，上機前補加1×binding buffer 200 μL，通過流式細胞儀檢測（1 h內完成）。實驗重復3次。

1.7Western blotting檢測相關蛋白表達

采用RIPA裂解液提取敲低IncRNA`-CCAT1`-siRNA的U251細胞、陰性對照U251細胞及未轉染的空白組U251細胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度?？偟鞍?00 ℃水浴變性5 min，按照每孔40 μg上樣，依次經100 g/L SDS`-PAGE電泳、轉膜及封閉膜后，TBST洗膜，將膜置于使用封閉液稀釋的一抗溶液中（1∶1 000稀釋的β`-catenin、cyclinD1和Survivin抗體及1∶2 000稀釋的內參GAPDH），4 ℃孵育過夜，次日，TBST洗膜，加HRP標記的二抗（1∶2 000稀釋），37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，暗室下X線膠片顯影、定影。使用Image J2x軟件對相應蛋白進行光密度分析。實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學方法

所有實驗數據采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用±s表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK`-q檢驗。

2結果

2.1敲低IncRNA`-CCAT1對CCAT1 mRNA表達影響

本文qRT`-PCR檢測結果表明，空白組、NC組和CCAT1`-siRNA組的CCAT1 mRNA表達量分別為1.000、0.974±0.048和0.302±0.026，CCAT1`-

2期劉柳，等. 敲低IncRNA`-CCAT1表達對膠質瘤細胞凋亡影響199

siRNA組CCAT1 mRNA表達較NC組和空白組明顯降低，差異均具有顯著意義（F=472.885， P<0.05），而NC組和空白組間CCAT1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2敲低IncRNA`-CCAT1表達對U251細胞活力影響

MTT檢測的各組細胞活力結果顯示，NC組和空白組在CCAT1`-siRNA轉染U251細胞24～96 h的細胞活力差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而CCAT1`-siRNA組從轉染48 h起細胞活力明顯低于空白組（F=10.415～23.775，P<0.05）。見圖1。

2.3敲低IncRNA`-CCAT1表達對U251細胞凋亡影響

流式細胞術檢測結果顯示，空白組、NC組和CCAT1`-siRNA組的細胞凋亡率分別為（3.66±0.32）%、（3.47±0.30）%和（24.48±2.03）% CCAT1`-siRNA組細胞凋亡率較NC組和空白組明顯升高，差異有顯著意義（F=304.267，P<0.05）。見圖2。

2.4敲低IncRNA`-CCAT1表達對Wnt/β`-catenin信號通路蛋白表達影響

Western blotting檢測各組細胞的β`-catenin、cyclinD1和Survivin蛋白表達結果顯示，CCAT1`-siRNA組β`-catenin、cyclinD1和Survivin的蛋白表達均明顯降低（F=13.372～100.869，P<0.05）。見圖3、表1。

3討論

越來越多的研究證實，腫瘤發(fā)生的分子機制不僅與蛋白編碼基因有關，與非編碼調節(jié)的RNA也有關系[9`-12]。近年大量的研究表明，人類基因組中有超過90%的LncRNA、siRNA、miRNA等非編碼RNA廣泛參與腫瘤發(fā)生、細胞代謝、免疫應答、胚胎發(fā)育等生理病理過程的調控[13`-15]。最近已發(fā)現多個LncRNA在膠質瘤中異常表達，且一些LncRNA可影響腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學特性[16]。CCAT1是近年來新發(fā)現的一種IncRNA，IncRNA`-CCAT1定位于染色體8q24.21，有多項研究表明IncRNA`-CCAT1可影響腫瘤進展[17`-19]。如IncRNA`-CCAT1可以通過抑制miR`-152促進肝外膽管癌的轉移、侵襲和EMT[17];LncRNA`-CCAT1可以通過上調Livin抑制腎癌細胞的凋亡[18];下調IncRNA`-CCAT1可通過調控miR`-148b增強乳癌化療敏感性[19]。以上研究提示，IncRNA`-CCAT1可能在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。已有研究證實，IncRNA`-CCAT1可以促進膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[8]，而CCAT1對膠質瘤細胞凋亡的影響及其機制目前尚未明確。因此，本研究探討了敲減IncRNA`-CCAT1表達后的膠質瘤細胞凋亡變化，結果顯示，IncRNA`-CCAT1表達降低可明顯抑制膠質瘤細胞活力、誘導細胞凋亡。

Wnt/β`-catenin信號通路也被稱為經典的Wnt信號，已被證實廣泛參與腫瘤形成、胚胎發(fā)育、細胞增殖等過程[20`-23]。β`-catenin是Wnt/β`-catenin信號通路的關鍵信號轉導分子，但各種因素引起Wnt分子表達增多時，可使胞質β`-catenin蛋白大量積聚，積聚的β`-catenin入核后與TCF/LEF家族轉錄因子結合，調控下游cyclinD1、survivin、c`-myc等一系列基因表達，進而影響腫瘤生物學特性[24`-26]。大量研究表明，Wnt/β`-catenin信號異?；罨c多種腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關系[27`-28]。如過表達SOX9可以通過Wnt/β`-catenin信號通路促進膠質瘤轉移[27];Wnt/β`-catenin信號通路抑制劑能夠抑制腦膠質瘤細胞增殖、遷徙及遷移能力[28]。此外，也有多項研究表明，IncRNA可通過調控Wnt/β`-catenin信號通路影響膠質瘤細胞生長[29`-30]。如IncRNA AB073614可通過下調SOX7激活Wnt/β`-catenin信號增加膠質瘤的惡性行為[29];高表達LncRNA CCND2`-AS1可通過Wnt/β`-catenin信號通路促進膠質瘤細胞增殖[30]。IncRNA`-CCAT1是否可通過調控Wnt/β`-catenin信號通路影響膠質瘤細胞凋亡還未清楚。本研究結果顯示，敲減IncRNA`-CCAT1表達可下調β`-catenin、cyclinD1和survivin表達。這提示IncRNA`-CCAT1誘導膠質瘤細胞凋亡與下調Wnt/β`-catenin信號通路有關。

綜上所述，敲減IncRNA`-CCAT1表達可抑制膠質瘤細胞活力、誘導細胞凋亡，其機制與下調Wnt/β`-catenin信號通路有關。目前關于IncRNA`-CCAT1對膠質瘤細胞生長的影響及機制研究較少，本研究也僅限于IncRNA`-CCAT1對膠質瘤細胞增殖、凋亡及Wnt/β`-catenin信號通路的影響，而IncRNA`-CCAT1對膠質瘤細胞凋亡影響是否通過其他信號途徑還未明確，值得進一步研究。

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