慈延?xùn)|　邱晨生　吳曉淋　方曉露　相宏飛　陳伯華

[摘要]目的比較細(xì)胞周期D1型結(jié)合蛋白1（CCNDBP1）在不同年齡階段腰椎間盤突出癥病人椎間盤中的表達(dá)，探討其與腰椎間盤退變的關(guān)系。方法收集不同年齡階段腰椎間盤突出癥病人共42例，其中30～歲、40～歲、50～歲年齡段病人各14例。取病人突出的椎間盤組織，蘇木精`-伊紅染色觀察其退變情況，采用免疫組化法、PCR法、Western印跡法從細(xì)胞、基因、蛋白水平檢測CCNDBP1的表達(dá)量。結(jié)果蘇木精`-伊紅染色結(jié)果顯示，各個年齡階段腰椎間盤突出癥病人腰椎間盤組織均有不同程度退變，退變程度與年齡呈正相關(guān)。免疫組化法、PCR法和Western印跡法檢測結(jié)果顯示，腰椎間盤組織CCNDBP1的表達(dá)隨病人年齡的增加而減少，其中30～歲年齡段病人CCNDBP1的表達(dá)顯著高于40～歲年齡段病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.42～168.30，t=3.06～6.78，P<0.05），40～歲年齡段病人CCNDBP1的表達(dá)顯著高于50～歲年齡段病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.58～9.91，P<0.05）。結(jié)論人腰椎間盤髓核組織退變過程中有CCNDBP1的參與，隨著年齡的增長，CCNDBP1在退變腰椎間盤組織中的表達(dá)量逐漸減少。

[關(guān)鍵詞]椎間盤移位;腰椎;細(xì)胞周期蛋白質(zhì)類;年齡因素

[中圖分類號]R681.53[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號] 2096`-5532（2019）02`-0128`-05

doi：10.11712/jms201902002[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF CYCLIN`-D1`-BINDING PROTEIN 1 IN THE INTERVERTEBRAL DISC OF PATIENTS WITH LUMBAR DISC HERNIATION AT DIFFERENT AGES CI Yandong， QIU Chensheng， WU Xiaolin， FANG Xiaolu， XIANG Hongfei， CHEN Bohua（Department of Spinal Surgery， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of cyclin`-D1`-binding protein 1 （CCNDBP1） in the intervertebral disc of patients with lumbar disc herniation at different ages and its association with lumbar disc degeneration. MethodsA total of 42 patients with lumbar disc herniation at different ages were enrolled， with 14 patients each in the 30-， 40-， and 50- year groups. The prominent intervertebral disc tissue was collected， and HE staining was used to observe disc degeneration. Immunohistoche`-mistry was used to measure the expression of CCNDBP1 in cells， and PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of CCNDBP1. ResultsHE staining showed varying degrees of lumbar disc degeneration in the patients with lumbar disc herniation at different ages， and the degree of degeneration was positively correlated with age. Immunohistochemistry， PCR， and Western blot showed that the expression of CCNDBP1 in the intervertebral disc decreased with age; the 30- year group had significantly higher expression of CCNDBP1 than the 40- year group （F=15.42-168.30，t=3.06-6.78，P<0.05）， and the 40- year group had significantly higher expression of CCNDBP1 than the 50- year group （t=2.58-9.91，P<0.05）. ConclusionCCNDBP1 is involved in the degeneration of human lumbar disc nucleus pulposus， and the expression of CCNDBP1 in the degenerated intervertebral disc gradually decreases with age.

[KEY WORDS]intervertebral disc displacement; lumbar vertebrae; cell cycle proteins; age factors

腰椎間盤位于椎體之間，由髓核、纖維環(huán)及軟骨終板組成。腰椎間盤突出癥已成為中老年人群較為常見的脊柱退行性疾病之一[1]，也是導(dǎo)致腰腿痛的主要原因[2]。近年來，我國腰椎間盤突出癥的發(fā)病率較以往有所提高，發(fā)病年齡有提前的趨勢[3`-4]。隨著對腰椎間盤突出癥病理研究的逐漸深入，細(xì)胞因子、炎性遞質(zhì)等在椎間盤突出癥中作用的研究日益增多，目前腰椎間盤突出癥發(fā)病機制的研究主要集中于損傷、退變、炎癥、免疫、遺傳等方面，但相應(yīng)的病因機制還不完全清楚[4]。近期有研究表明，細(xì)胞周期D1型結(jié)合蛋白1（CCNDBP1）可能參與了腰椎間盤退行性改變[5]，但其在椎間盤內(nèi)表達(dá)情況及在椎間盤退行性變中的作用尚不明確。本研究擬檢測CCNDBP1在不同年齡段腰椎間盤突出癥病人腰椎間盤組織中的表達(dá)，分析CCNDBP1與腰椎間盤退變的關(guān)系，為延緩椎間盤退變提供新的方向。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年11月—2018年3月在我院行手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥病人42 例。病人年齡為30～60歲，平均43歲，其中30～歲、40～歲、50～歲年齡段病人各14例。術(shù)前行腰椎 X 線片及腰椎CT檢查診斷為單純腰椎間盤突出，并經(jīng)腰椎MRI檢查證實，腰椎間盤退變臨床分級均為Pfirrmann Ⅲ～Ⅴ級。病人查體符合腰椎間盤突出癥臨床診療共識標(biāo)準(zhǔn)，且均有1～2項肯定的對應(yīng)神經(jīng)癥狀及體征，均無腰椎側(cè)彎、腰椎滑脫和腰椎骨折等其他腰椎病變。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人及家屬均簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本處理

術(shù)中取出的椎間盤組織用滅菌生理鹽水清洗后，取部分送病理檢查，其余組織置液氮中保存待用。選擇術(shù)中收集的部分腰椎間盤組織（選取L3/4、L4/5、L5/S1節(jié)段），用40 g/L的甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片。所有標(biāo)本均選取5張有髓核細(xì)胞切片，其中2張切片行蘇木精`-伊紅染色，另3張切片進(jìn)行免疫組化染色。

1.3主要材料

TRIzol Reagent 購自TaKaRa公司;CCNDBP1一抗購自美國Abcam公司;CCNDBP1二抗和內(nèi)參一抗購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;DAB顯色試劑盒購自美國 Millipore公司。

1.4檢測方法

1.4.1蘇木精`-伊紅染色椎間盤組織石蠟切片行蘇木精`-伊紅染色后，在高倍（200倍）光學(xué)顯微鏡下觀察椎間盤細(xì)胞及細(xì)胞外膠原纖維形態(tài)學(xué)變化。

1.4.2免疫組化染色檢測CCNDBP1的表達(dá)將椎間盤組織切片置于荷電切片上，在60 ℃下烘烤40 min，行去親合、再水化，放入沸水中2 min，用檸檬酸鈉緩沖液（pH值6.0）進(jìn)行熱抗原修復(fù)40 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水和PBS洗滌15 min，將體積分?jǐn)?shù)為0.03的過氧化氫滴加至切片上，37 ℃孵育10 min，加入CCNDBP1一抗（1∶500）孵育1 h，用蒸餾水和PBS洗滌后，加入CCNDBP1二抗孵育40 min，組織電位暴露1 min，蘇木精作用50 s，分化液作用1 s，滴加中性樹膠，封片后顯微鏡下觀察。

1.4.3PCR方法檢測CCNDBP1 mRNA的表達(dá)從液氮中取出椎間盤組織制作勻漿，取100 mg加1 mL TRIzol提取總RNA。震蕩混勻后室溫靜置5 min，移入EP管中，4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，移入新的EP管中，加入200 μL的氯仿，上下混勻后室溫靜置5 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相移入新的EP管中，加入0.5 mL的異丙醇混勻，室溫放置10 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，去除上清液體，用1 mL體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇洗滌沉淀，懸浮后4 ℃下以7 500 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀物室溫干燥 10 min，溶于DEPC 水中。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果，計算機進(jìn)行圖像處理。另取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行qRT`-PCR。CCNDBP1上游引物為5′`-ACAAGTCCATGCTGCCATCAAGG`-3′，下游引物為 5′`-GAGCTGAGCCATGCCATCCAC`-3′。按照轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上樣，在 PCR 儀上進(jìn)行基因擴增。采用2-△△Ct法計算各組樣本CCNDBP1的表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.4.4Western法檢測CCNDBP1蛋白的表達(dá)將椎間盤組織從液氮中取出，用剪刀剪碎，加入蛋白提取裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑，用組織勻漿器充分研磨組織，轉(zhuǎn)入EP管中，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸取上清液移入新的EP管中，提取出組織中總蛋白。蛋白用紫外線分光光度計進(jìn)行定量，加入蛋白上樣緩沖液后保存于-80 ℃冰箱中。取等量蛋白質(zhì)用40～120 g/L的SDS`-PAGE凝膠電泳，將蛋白印跡轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒壓110 V，電流300 mA，1.5 h），加入50 g/L脫脂奶粉`-TBST封閉液常溫封閉1.5 h。加GAPDH單克隆一抗（1∶3 000）、CCNDBP1一抗（1∶1 000），置4 ℃冰箱中過夜。加入二抗室溫下?lián)u1 h，用化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像。計算機圖像處理后測定各個條帶的灰度值，目的蛋白表達(dá)量以目的條帶與內(nèi)參照條帶灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，多組均數(shù)比較采用方差分析。

2結(jié)果

2.1蘇木精`-伊紅染色

各個年齡段腰椎間盤突出癥病人腰椎間盤組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)模糊程

130青島大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）55卷

度以及細(xì)胞稀疏程度隨年齡的增大逐漸加重，髓核細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，髓核細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則程度加重。

2.2免疫組化染色

所有病人椎間盤組織中均有CCNDBP1的表達(dá)，30～歲年齡段病人椎間盤組織中CCNDBP1陽性細(xì)胞數(shù)量最多，顏色最深;40～歲年齡段病人陽性細(xì)胞數(shù)量次之，顏色較淺;50～歲年齡段病人陽性細(xì)胞數(shù)量最少，顏色最淺。

2.3不同年齡段病人腰椎間盤組織中CCNDBP1 mRNA表達(dá)比較

2.3.1RT`-PCR檢測30～歲、40～歲、50～歲年齡段病人椎間盤組織均有一定程度的CCNDBP1 mRNA表達(dá)，且其表達(dá)隨腰椎間盤突出癥病人年齡的增大而下降。見圖1。

2.3.2qRT`-PCR檢測腰椎間盤突出癥病人年齡越大，其腰椎間盤組織CCNDBP1 mRNA的表達(dá)越低。30～歲年齡段病人CCNDBP1 mRNA表達(dá)水平顯著高于40～歲年齡段病人（F=168.30，t=6.78，P<0.01），而40～歲年齡段病人CCNDBP1 mRNA的表達(dá)又顯著高于50～歲年齡段病人（t=9.91，P<0.01）。見圖2。

2.4不同年齡段病人腰椎間盤組織CCNDBP1蛋白表達(dá)比較

腰椎間盤突出癥病人年齡越大，其腰椎間盤組織CCNDBP1蛋白的表達(dá)越低。30～歲年齡段病人不同節(jié)段腰椎間盤組織CCNDBP1的表達(dá)顯著高于40～歲年齡階段病人（F=15.42～23.38，t=3.06～3.83，P<0.05），40～歲年齡段病人CCNDBP1的表達(dá)顯著高于50～歲年齡階段病人（t=2.58～4.50，P<0.05）。同一年齡段病人不同節(jié)段腰椎間盤組織CCNDBP1蛋白的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3討論

椎間盤退變被認(rèn)為是椎間盤突出等疾病的病理基礎(chǔ)，人們已經(jīng)從分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)等方面對退變椎間盤進(jìn)行了相關(guān)的研究，但椎間盤退變的確切機制仍存在爭議，需要進(jìn)一步的研究[6]。近年研究表明，細(xì)胞因子在腰椎間盤退變、突出過程中起著極為重要的作用[7`-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤突出癥病人的椎間盤標(biāo)本中存在免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[9]。NAYLOR等[10]首先提出了椎間盤突出的自身免疫學(xué)說，認(rèn)為椎間盤組織是一種潛在的抗原，當(dāng)纖維環(huán)破裂后會產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。研究證明，自身抗體通過巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，并與細(xì)胞免疫共同作用于椎間盤，引起椎間盤組織的損傷，造成椎間盤生物力學(xué)改變，使椎間盤基質(zhì)降解加速，促進(jìn)椎間盤突出[11`-13]。KAWAGUCHI等[14]研究結(jié)果表明，椎間盤突出與炎癥反應(yīng)致組織損傷或化學(xué)刺激有關(guān)。TAPIA等[15]研究表明，椎間盤損傷修復(fù)過程中有巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤，釋放大量的細(xì)胞因子，導(dǎo)致免疫反應(yīng)引起組織損傷。

CCNDBP1最初由TERAI等[16]和YAO等[17]確定是細(xì)胞周期蛋白D（Cyclin D）與白細(xì)胞特異性適配蛋白（Grap2）相互作用結(jié)合的蛋白。XIA等[18]研究表明，CCNDBP1在肌肉、心臟、白細(xì)胞和大腦中的表達(dá)是最高的。CCNDBP1通過Grap2和Cyclin D介導(dǎo)的信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖，

2期慈延?xùn)|，等. 不同年齡腰突出椎間盤組織CCNDBP1表達(dá)及意義131

從而啟動DNA的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。CCNDBP1含有一個假定的HLH結(jié)構(gòu)，沒有基本的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可能作為轉(zhuǎn)錄因子（如ID蛋白家族的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子）發(fā)揮作用[19`-22]。椎間盤髓核細(xì)胞衰老是已經(jīng)確認(rèn)的引起椎間盤退變的重要原因[23]。有研究表明，CCNDBP1在免疫系統(tǒng)細(xì)胞信號機制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控肝臟特異性基因的突變機制中起作用[24]。BABU等[5]研究結(jié)果顯示，正常椎間盤組織CCNDBP1的表達(dá)明顯高于退變椎間盤組織。CCNDBP1表達(dá)可能與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的分化和增殖有關(guān)[12]。本實驗從細(xì)胞、基因、蛋白水平檢測CCNDBP1的表達(dá)，結(jié)果顯示，腰椎間盤突出癥病人椎間盤組織中CCNDBP1的表達(dá)隨年齡的增長而降低，提示CCNDBP1可能通過參與椎間盤退變過程中免疫反應(yīng)并抑制椎間盤細(xì)胞的凋亡來延緩椎間盤的退變。

有研究表明，CCNDBP1在終末分化組織中高度表達(dá)，在增殖細(xì)胞中的表達(dá)減少[25]。目前，關(guān)于CCNDBP1的研究多集中在腫瘤領(lǐng)域，而在椎間盤方面的研究尚未見報道。MA等[26]研究顯示，在結(jié)腸腫瘤中CCNDBP1通過特異性小干擾RNA表達(dá)促進(jìn)了集落形成而表達(dá)減少，表明CCNDBP1可以作為潛在的腫瘤因子。還有研究表明，CCNDBP1可以在細(xì)胞分化和增殖控制方面發(fā)揮重要作用，已被確定為潛在的原癌基因[27`-29]。本研究通過蘇木精`-伊紅染色和免疫組化染色觀察到，退變椎間盤組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，隨年齡的增大細(xì)胞數(shù)量更少，表明CCNDBP1可能參與細(xì)胞的增殖過程。本文研究結(jié)果還顯示，CCNDBP1在不同年齡階段腰椎間盤突出癥病人椎間盤組織中均有表達(dá)，隨年齡增加其表達(dá)量逐漸減少，初步揭示了CCNDBP1在椎間盤退變中的作用。當(dāng)退變或外傷導(dǎo)致椎間盤自身抗原成分與血液循環(huán)接觸后，機體會產(chǎn)生自身免疫、炎癥反應(yīng)，腰椎間盤突出發(fā)生過程可能與免疫及炎癥反應(yīng)有關(guān)。NERLICH 等[30]研究結(jié)果表明，人類椎間盤髓核組織中存在CD68 陽性的炎性細(xì)胞，它們參與了椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的吞噬降解過程。CCNDBP1可能通過參與免疫反應(yīng)，如通過影響CD68細(xì)胞抑制椎間盤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)椎間盤細(xì)胞的分化與增殖，緩解椎間盤退變，今后可研究椎間盤組織中的炎性細(xì)胞因子以進(jìn)一步揭示CCNDBP1的作用機制。

綜上所述，CCNDBP1在腰椎間盤組織中的表達(dá)隨年齡的增長而減少。本實驗結(jié)果初步揭示了CCNDBP1與椎間盤退變的關(guān)系，為延緩椎間盤退變提供了新的方向與線索。但椎間盤退變的機制較為復(fù)雜，CCNDBP1在椎間盤退變進(jìn)程中的具體作用機制及其與其他因素的關(guān)聯(lián)及相互影響仍需進(jìn)一步探討。

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