范兆陽(yáng)　鮮文峰　劉永喜

[摘要]目的探討小分子干擾RNA（siRNA）沉默Polo樣激酶1（PLK1）基因?qū)侨饬黾?xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法培養(yǎng)人骨肉瘤MG`-63細(xì)胞，將其隨機(jī)分為空白組、siRNA`-對(duì)照序列組和siRNA`-PLK1組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中PLK1蛋白表達(dá)，CCK`-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果siRNA`-PLK1組細(xì)胞中PLK1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于空白組和siRNA`-對(duì)照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=129.125、62.363，P<0.01）。與空白組和siRNA`-對(duì)照序列組相比，siRNA`-PLK1組細(xì)胞培養(yǎng)48、72和96 h時(shí)的增殖活性均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=32.021，F(xiàn)時(shí)間=357.249，F(xiàn)交互=5.755，P<0.01）。與空白組和siRNA`-對(duì)照序列組相比，siRNA`-PLK1組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.863，P<0.01）。siRNA`-PLK1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于空白組和siRNA`-對(duì)照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.998、34.783，P<0.01）。結(jié)論特異性沉默骨肉瘤細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)可減少細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞侵襲、遷移能力。

[關(guān)鍵詞]骨肉瘤;Polo樣激酶1;RNA，小分子干擾;細(xì)胞生物學(xué)

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of small interfering RNA （siRNA） silencing of polo`-like kinase 1 （PLK1） on the biological characteristics of osteosarcoma cells. MethodsHuman osteosarcoma MG`-63 cells were cultured and randomly divided into blank group， siRNA`-control sequence group， and siRNA`-PLK1 group. Quantitative real`-time PCR and Wes`-tern blot were used to measure the mRNA and protein expression of PLK1 in cells; CCK`-8 assay was used to measure cell proliferation acti`-vity; flow cytometry was used to measure cell apoptosis; the Transwell method was used to measure cell migration and invasion abilities. ResultsThe siRNA`-PLK1 group had significantly lower relative mRNA and protein expression of PLK1 in cells than the blank group and the siRNA`-control sequence group （F=129.125 and 62.363，P<0.01）. Compared with the blank group and the siRNA`-control sequence group， the siRNA`-PLK1 group had significant reductions in proliferation activity at 48， 72， and 96 h of culture （Fgroup=32.021，F(xiàn)time=357.249，F(xiàn)interaction=5.755，P<0.01）. Compared with the blank group and the siRNA`-control sequence group， the siRNA`-PLK1 group had a significant increase in cell apoptosis rate （F=69.863，P<0.01）. The siRNA`-PLK1 group had significantly lower numbers of migrating cells and invasive cells than the control group and the siRNA`-control sequence group （F=28.998 and 34.783，P<0.01）. ConclusionSpecific silencing of PLK1 gene expression in osteosarcoma cells can reduce cell proliferation， increase cell apoptosis， and inhibit cell invasion and migration.

[KEY WORDS]osteosarcoma; Polo`-like kinase 1; RNA， small interfering; cell biology

骨肉瘤好發(fā)于青少年人群，惡性程度高，可早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后多不良[1]，嚴(yán)重威脅病人生存健康。近年來(lái)，雖然臨床診療水平不斷進(jìn)步，但骨肉瘤病人復(fù)發(fā)率和5年生存率并未得到明顯改善[2]。有研究指出，骨肉瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)是影響腫瘤預(yù)后的主要因素[3]。但目前影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全清楚。Polo樣激酶1（PLK1）是PLK家族重要成員，是一種高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞分裂、DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[4]。有研究指出，PLK1在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，參與了腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程[5]。本研究利用小分子干擾RNA（siRNA）技術(shù)特異性沉默人骨肉瘤MG`-63細(xì)胞系中的PLK1基因，觀察其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以期為骨肉瘤機(jī)制研究及臨床診治提供基礎(chǔ)資料?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1主要材料

人骨肉瘤MG`-63細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，RPMI`-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京方程佰金科技公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，PLK1及內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，siRNA`-PLK1、siRNA`-對(duì)照序列由上海吉瑪制藥技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，兔抗人PLK1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司，Annexin V`-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio`-rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組MG`-63細(xì)胞加含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染[6]，并將細(xì)胞分為以下3組。①空白組（A組）：不作任何處理;②siRNA`-對(duì)照序列組（B組）：轉(zhuǎn)染對(duì)照序列5′`-AAUUUGGCCGGGCCGU`-GCG`-3′;③siRNA`-PLK1組（C組）：轉(zhuǎn)染PLK1基因的siRNA序列5′`-AAGGGCGGCUUUGCCAA`-GUGC`-3′。各組轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰酶消化后，用裂解液裂解，按Trizol總RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA，并檢測(cè)純度和濃度，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板行PCR。PLK1及內(nèi)參引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃、3 min，95 ℃、40 s，58 ℃、40 s，70 ℃、40 s，循環(huán)36次。每個(gè)樣本均設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔。用2-△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中PLK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量[7]。

1.2.3Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中PLK1蛋白的表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰酶消化后用裂解液裂解，提取細(xì)胞中總蛋白，用BCA總蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白純度和濃度。取30 μg總蛋白，行SDS`-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下用含50 g/L脫脂奶粉的TBST封閉60 min，加入一抗兔抗人PLK1多克隆抗體（稀釋比例1∶1 000），4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，室溫下孵育120 min，TBST洗膜3次，加入ECL避光反應(yīng)25 min，拍照，應(yīng)用Image J圖像分析軟件對(duì)灰度值進(jìn)行定量分析，獲得各組細(xì)胞中PLK1蛋白相對(duì)表達(dá)量[8]。

1.2.4CCK`-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，消化后接種于96孔板中，將細(xì)胞密度調(diào)整為每孔2×104個(gè)，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h時(shí)，將孔板中的培養(yǎng)液去除，加入100 μL的無(wú)血清培養(yǎng)液和10 μL的CCK`-8溶液，空白組僅加入無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃恒溫孵育120 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A）值[9]。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，用1×緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，取100 μL細(xì)胞懸液加入流式管中，再分別加入5 μL的Annexin V`-FITC和PI，搖勻，室溫下在暗室中孵育20 min，60 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)[10]。

1.2.6Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力遷移能力檢測(cè)：取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，消化，離心，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取2×104個(gè)細(xì)胞加入小室上室，將含體積分?jǐn)?shù)0.20胎牛血清的RPMI`-1640培養(yǎng)液600 μL加入下室，培養(yǎng)24 h，甲醛固定，10 g/L結(jié)晶紫染色，將散落的細(xì)胞用棉簽輕輕去除，以PBS沖洗3次，拍照，于高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)[11`-12]。侵襲能力檢測(cè)：取50 μL的Matrigel膠平鋪于Transwell小室內(nèi)側(cè)，風(fēng)干后備用;其余步驟同遷移能力檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析和LSD`-t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2期范兆陽(yáng)，等. siRNA沉默PLK1基因?qū)侨饬黾?xì)胞生物學(xué)特性影響173

2結(jié)果

2.1PLK1在各組細(xì)胞中的表達(dá)

與空白組和siRNA`-對(duì)照序列組比較，siRNA`-PLK1組細(xì)胞中PLK1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=129.125、62.363，P<0.01）。見表2和圖1。

2.2各組細(xì)胞增殖活性比較

與空白組和siRNA`-對(duì)照序列組比較，siRNA`-PLK1組細(xì)胞培養(yǎng)48、72和96 h時(shí)的A值均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=32.021，F(xiàn)時(shí)間=357.249，F(xiàn)交互=5.755，P<0.01）。見表3。

2.3各組細(xì)胞凋亡率比較

siRNA`-PLK1組、siRNA`-對(duì)照序列組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為（6.7±2.2）%、（6.5±0.9）%和（14.9±1.4）%，與空白組和siRNA`-對(duì)照序列組比較，siRNA`-PLK1組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.863，P<0.01）。

2.4各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

siRNA`-PLK1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于空白組和siRNA`-對(duì)照序列組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.998、34.783，P<0.01）。見表4。

3討論

骨肉瘤作為嚴(yán)重威脅青少年健康的常見惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，約20%的病人在臨床確診時(shí)已出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，約50%的病人在治療過(guò)程中發(fā)生肺轉(zhuǎn)移[13`-15]。目前，骨肉瘤病人整體治療效果仍不佳，多數(shù)病人預(yù)后不良，5年生存率尚不足30%[16]。細(xì)胞異常增殖和侵襲是骨肉瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及治療失敗的主要原因[17`-18]。PLK1作為絲/蘇氨酸激酶家族成員，在調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)有絲分裂及胞質(zhì)分裂中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[19`-20]。研究表明，多數(shù)惡性腫瘤組織中PLK1呈高表達(dá)，且與病人預(yù)后有關(guān)[21`-23]。抑制或敲除PLK1基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加其對(duì)化療藥物的敏感性，且不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影響[24]。有研究表明，PLK1抑制劑可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且PLK1蛋白水平的高表達(dá)與病人不良預(yù)后密切相關(guān)[25]。

本研究利用siRNA技術(shù)特異性下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中PLK1表達(dá)，結(jié)果顯示，siRNA`-PLK1組細(xì)胞中PLK1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，表明PLK1基因表達(dá)被抑制。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA`-PLK1組細(xì)胞培養(yǎng)48、72和96 h時(shí)的A值均較siRNA`-對(duì)照序列組和空白組明顯降低，說(shuō)明特異性抑制PLK1基因表達(dá)可有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，這與以往的有關(guān)研究結(jié)論相一致[26]。劉曉影等[27]通過(guò)建立食管鱗癌細(xì)胞裸鼠移植瘤研究顯示，下調(diào)PLK1表達(dá)可抑制移植瘤的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，特異性抑制骨肉瘤細(xì)胞中PLK1基因表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞凋亡率顯著增加，說(shuō)明抑制PLK1基因表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。毛永歡等[28]的研究結(jié)果亦表明，靶向沉默PLK1基因可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡。有研究表明，PLK1基因與細(xì)胞分裂關(guān)系密切，在肝癌等實(shí)體腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移中發(fā)揮重要作用[29]。丁克云等[30]研究表明，干擾PLK1表達(dá)可抑制惡性黑素瘤細(xì)胞的侵襲，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)失巢凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，siRNA`-PLK1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)較siRNA`-對(duì)照序列組和空白組均減少，說(shuō)明PLK1基因表達(dá)與骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力有關(guān)，提示PLK1基因可能參與了骨肉瘤細(xì)胞侵襲、遷移過(guò)程，并在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，沉默PLK1基因表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且可抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力，有望為骨肉瘤臨床診療提供新的靶位。下一步我們將從分子生物學(xué)角度更加深入探討PLK1在骨肉瘤發(fā)生及進(jìn)展中的作用機(jī)制。

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