蔣立奔 林碩 陳勇 余蕓 陳藝欣 田厚軍 魏輝

摘 要：【目的】斜紋夜蛾Spodoptera litura Fabricius是一種多食性害蟲，繁殖能力強(qiáng)，全球范圍內(nèi)均有分布。但是寄主對斜紋夜蛾繁殖力影響機(jī)制還不清楚。開展寄主對斜紋夜蛾實(shí)驗(yàn)種群生殖力的影響研究，為斜紋夜蛾的預(yù)測預(yù)報(bào)以及防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^單頭飼養(yǎng)的方法，研究斜紋夜蛾取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜后的產(chǎn)卵量、卵黃原蛋白（Vg）及卵黃原蛋白受體（VgR）表達(dá)的變化?！窘Y(jié)果】幼蟲取食不同寄主的成蟲壽命和產(chǎn)卵前期沒有顯著性差異，但成蟲的產(chǎn)卵量、Vg及VgR表達(dá)量有顯著差異。取食人工飼料的斜紋夜蛾產(chǎn)卵量最多，為（889±43.0）粒，其次為取食地瓜（496±53.1）粒、空心蓮子草（362±37.3）粒，和甘藍(lán)（193±9.7）粒。取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜的斜紋夜蛾雌蟲卵巢Vg和VgR的相對表達(dá)量僅為取食人工飼料斜紋夜蛾的40%～80%，且取食不同寄主的斜紋夜蛾Vg和VgR的相對表達(dá)量與產(chǎn)卵量呈正相關(guān)關(guān)系。【結(jié)論】斜紋夜蛾取食不同寄主后，其卵巢內(nèi)的Vg和VgR表達(dá)量存在差異，從而影響到斜紋夜蛾卵子發(fā)育，最終造成其生殖力存在差異。

關(guān)鍵詞：斜紋夜蛾;產(chǎn)卵量;卵黃原蛋白;卵黃原蛋白受體

中圖分類號：S 435文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）02-235-06

0 引言

【研究意義】在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，昆蟲與寄主植物之間形成了形式多樣、相互聯(lián)系和相互適應(yīng)的關(guān)系。寄主植物的特性（營養(yǎng)物質(zhì)種類和含量）在植食性昆蟲的生長繁殖中起到重要作用，特別對昆蟲種群繁殖能力有重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]。因此，明確寄主植物對害蟲生殖能力影響機(jī)制對害蟲綜合治理和預(yù)測預(yù)報(bào)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲生殖調(diào)控的關(guān)鍵步驟就是卵黃發(fā)生，卵黃發(fā)生的研究對于昆蟲繁殖力的控制具重要意義[4]。卵黃原蛋白（Vitellogenin， Vg）作為卵黃蛋白的前體，由脂肪體合成后運(yùn)送到血淋巴，再通過卵黃原蛋白受體（Vitellogenin receptor， VgR）內(nèi)吞作用攝取。卵黃原蛋白分子在脂肪體中被蛋白水解，通過翻譯前和翻譯后的修飾，促進(jìn)碳水化合物、脂質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)铰殉玻瑸檎诎l(fā)育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素和微量元素等營養(yǎng)和功能性物質(zhì)[5-7]。近年來通過干擾昆蟲的生殖功能，使其不能交配或繁衍后代，從而實(shí)現(xiàn)害蟲的有效治理是昆蟲學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。斜紋夜蛾Spodoptera litura（Fabricius）屬鱗翅目夜蛾科，是一種雜食性、暴食性害蟲，廣泛分布于亞洲、大洋洲、太平洋西岸、中東等許多國家和地區(qū)，也是我國重要農(nóng)業(yè)害蟲之一[8]。已有報(bào)道斜紋夜蛾的寄主范圍包括蔬菜、花卉、果樹、煙草、草坪、灌木、喬木等109 科389 種植物[9-10]，具有很強(qiáng)的繁殖能力和遠(yuǎn)距離遷飛能力，嚴(yán)重危害時(shí)可造成作物嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失[11-12]。【本研究切入點(diǎn)】目前對斜紋夜蛾的防治仍以化學(xué)防治為主，而殺蟲劑的大量使用，導(dǎo)致斜紋夜蛾對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性[13]。有效天敵的匱乏與抗藥性是目前斜紋夜蛾防治工作的主要障礙。因此，探索防治斜紋夜蛾的高效、環(huán)保新途徑迫在眉睫。前人研究表明斜紋夜蛾取食不同寄主后生殖能力有顯著差異[14-16]，但主要集中研究其生物學(xué)及生理指標(biāo)，其內(nèi)在分子機(jī)制還未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選取空心蓮子草、甘藍(lán)和地瓜作為寄主，研究其對斜紋夜蛾雌蛾生殖能力的影響，一方面可以從分子水平闡釋不同寄主模式下雌蛾產(chǎn)卵差異的內(nèi)在機(jī)制，另一方面為減少農(nóng)藥使用，減緩其抗藥性的產(chǎn)生，控制斜紋夜蛾種群增長以及生態(tài)調(diào)控提供一個(gè)可能途徑，具有重要的實(shí)踐價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與作物

斜紋夜蛾幼蟲采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜試驗(yàn)田（未噴施農(nóng)藥），室內(nèi)利用單卵塊篩選2代，在未接觸任何殺蟲劑的條件下以人工飼料（主要成分為玉米粉、黃豆粉、白糖、酵母粉、抗壞血酸等）連續(xù)飼養(yǎng)3年以上。飼養(yǎng)條件是溫度27℃，相對濕度75%～80% RH，光照12∶12 （L∶D）。

供試作物為空心蓮子草Alternanthera philoxeroides （Mart.） Griseb、甘藍(lán)Brassica oleracea L.和地瓜Ipomoea batatas （L.） Lam，分別種植在試驗(yàn)田中，未噴施農(nóng)藥。

1.2 成蟲產(chǎn)卵量測定

將同一天孵化的初孵幼蟲單頭放人直徑5 cm塑料培養(yǎng)皿中，分別飼喂空心蓮子草葉片、甘藍(lán)葉片和地瓜葉片，每天更換寄主植物葉片，以人工飼料為對照。待成蟲羽化后，將雌雄配對置于塑料盒（長×寬×高=12 cm×12 cm×18 cm）中，并飼以10%的蜂蜜水。盒底放置紗布（長×寬=12 cm×12 cm），供雌蛾產(chǎn)卵。每天更換蜂蜜水和產(chǎn)卵紗布，記錄成蟲的產(chǎn)卵數(shù)量直至其死亡。每組處理30對成蟲。飼養(yǎng)條件同1.1。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 斜紋夜蛾卵巢獲取

分別收集取食不同寄主植物的羽化后1、2、3、4、5、6、7、8 d的斜紋夜蛾雌蟲，蟲體固定在底部置有冰盒的蠟盤中，倒入一定量磷酸鹽緩沖鹽水（PBS： 137 mmol·L-1 NaCl; 2.7 mmol·L-1 KCl; 8 mmol·L-1 Na2HPO4; 1.5 mmol·L-1 KH2PO4; pH 7.5）沒過蟲體。在體視顯微鏡下，蟲體背面向上，用剪刀剪出T字形開口，拉開體壁并固定。取出卵巢置于離心管中。解剖后的樣品置于液氮中暫存。每天收集10只雌蟲，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 卵巢總RNA提取及qRT-PCR

斜紋夜蛾卵巢組織的RNA提取采用Trizol（Invitrogen）法[17]。利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)斜紋夜蛾SlVg（EU095334）、SlVgR（LOC111350990）和β-Actin（DQ494753）（擴(kuò)增片段大小約為150～250 bp）引物（表1）。RT-PCR分別獲得SlVg、SlVgR和β-Actin基因的cDNA模板。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green PCR MasterMix kit （Promega Crop） 10 μL，cDNA模板2 μL，引物各0.4 μL，RNase-free H2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃15 s，40循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。獲得的CT值利用2-△△CT計(jì)算SlVg和SlVgR基因的相對表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同寄主對斜紋夜蛾成蟲產(chǎn)卵及壽命的影響

圖1顯示，幼蟲取食人工飼料、甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜的成蟲壽命沒有顯著差別（F=1.71， df1=3， df2=8， P=0.264），但成蟲的產(chǎn)卵量有顯著不同（F=19.82， df1=3， df2=8， P=0.001）。取食人工飼料的斜紋夜蛾產(chǎn)卵量達(dá)到單雌（889±43）粒，顯著高于取食地瓜（496±53.1）粒、空心蓮子草（362±37.3）粒和甘藍(lán)（193±9.7）粒（圖1）。此外，由圖2看出，幼蟲取食人工飼料、甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜的成蟲產(chǎn)卵前期均為2 d，羽化后第3～5 d為產(chǎn)卵高峰期，此后日均產(chǎn)卵量逐漸降低。

2.2 不同寄主對斜紋夜蛾成蟲卵巢Vg和VgR的影響

通過RT-qPCR分析取食不同食物對斜紋夜蛾成蟲卵巢Vg和VgR的影響，結(jié)果表明，取食不同食物的斜紋夜蛾Vg和VgR的mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，均在羽化后1～2 d達(dá)到峰值，隨后開始下降，到第8 d時(shí)僅為峰值的20%～30%（圖3）;同時(shí)，取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜斜紋夜蛾雌蟲Vg和VgR的相對表達(dá)量僅為取食人工飼料斜紋夜蛾的40%～80%。此外，比較取食不同食物的斜紋夜蛾雌蟲日均產(chǎn)卵量與Vg和VgR的mRNA相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在Vg和VgR表達(dá)量達(dá)到峰值后2～3 d，斜紋夜蛾日均產(chǎn)卵量達(dá)到高峰期（圖2～3），表明雌蟲產(chǎn)卵量與Vg和VgR表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

許多昆蟲可危害多種寄主植物，由于不同寄主植物所含有的營養(yǎng)成分不同，從而對幼蟲和蛹的生長發(fā)育會產(chǎn)生一定的影響，同時(shí)也會對成蟲的產(chǎn)卵能力有較大影響[2， 18-19]。研究表明，取食人工飼料的斜紋夜蛾幼蟲存活率顯著高于取食棉花、甘藍(lán)和大豆[16]。本研究結(jié)果表明，取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜對斜紋夜蛾雌成蟲的壽命無顯著影響，與涂業(yè)茍等[16]、欒玉柱等[20]研究結(jié)果相似。但是，取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜的斜紋夜蛾產(chǎn)卵量顯著低于取食人工飼料，與前人研究結(jié)果差異較大[16， 18-20]，這可能由不同地理種群差異造成的。這些試驗(yàn)結(jié)果說明，斜紋夜蛾在取食不同品種的寄主之后，雖然對雌成蟲壽命無影響，但是對其生殖能力仍有較大影響。這可能與不同品種寄主植物葉片中蛋白質(zhì)和微量元素等含量不同，以及葉片中苯酚類等抗蟲組分不同有關(guān)[21-22]。因此，不同寄主植物對斜紋夜蛾種群的增殖可能有較大的影響，人工飼料是開展實(shí)驗(yàn)種群飼養(yǎng)的理想食料。

昆蟲卵子發(fā)生是營養(yǎng)型，營養(yǎng)的缺失可能會抑制Vg的合成及卵子的發(fā)育[23]。本研究表明，取食3種不同寄主植物的斜紋夜蛾卵巢中Vg的相對表達(dá)量顯著低于取食人工飼料的斜紋夜蛾，該結(jié)果與取食不同食物的斜紋夜蛾日均產(chǎn)卵量一致。此外，斜紋夜蛾卵巢中VgR的表達(dá)量與Vg表達(dá)趨勢一致。因此，我們猜測取食不同寄主植物后斜紋夜蛾體內(nèi)Vg基因表達(dá)水平的差異最終導(dǎo)致了斜紋夜蛾生殖的差異。同時(shí)，昆蟲卵黃原蛋白從合成啟動(dòng)到被卵母細(xì)胞特異性吸收均受卵發(fā)育神經(jīng)分泌激素（EDNH）、保幼激素（JH）和蛻皮激素（MH）等昆蟲激素的調(diào)節(jié)[24]。姚曉明[3]研究發(fā)現(xiàn)取食甘藍(lán)的蛻皮激素含量最低而保幼激素含量明顯高于取食其他的寄主植物。因此，我們推測取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜的斜紋夜蛾體內(nèi)Vg表達(dá)水平低于取食人工飼料，可能是寄主品質(zhì)差異導(dǎo)致體內(nèi)激素含量等指標(biāo)的差異，從而調(diào)控Vg基因的表達(dá)與合成，最終表現(xiàn)出產(chǎn)卵量的差異。取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜對斜紋夜蛾體內(nèi)關(guān)鍵激素影響與生殖能力的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)的結(jié)果初步說明，取食甘藍(lán)、空心蓮子草和地瓜的斜紋夜蛾產(chǎn)卵量顯著低于取食人工飼料，取食不同食物的斜紋夜蛾日均產(chǎn)卵量動(dòng)態(tài)變化與卵巢中Vg和VgR相對表達(dá)量一致，該結(jié)果為進(jìn)一步研究斜紋夜蛾卵子發(fā)生機(jī)制奠定理論依據(jù)，也為斜紋夜蛾的預(yù)測預(yù)報(bào)以及防治提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：林海清）