陳漢鑫 鞠玉棟 萬(wàn)學(xué)鋒

摘 要：【目的】以青蟹壽及其全錦突變體qj為材料，研究多肉植物錦化變異分子機(jī)理?！痉椒ā坷梅止夤舛扔?jì)法、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），分別測(cè)量其葉綠素、類胡蘿卜素含量及其相關(guān)基因的表達(dá)水平，并篩選差異顯著的相關(guān)代謝途徑?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，qj的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量顯著下降;對(duì)青蟹壽及qj葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分別獲得44 988 938和37 271 576 條Reads，經(jīng)過(guò)濾拼接組裝得到45 226條Unigene;所得Unigene的Nr注釋分類中有26 999條，Swissport注釋有20 279條，KOG注釋有16 943條，KEGG注釋有10 775條;篩選獲得表達(dá)差異顯著基因共20 305條，涉及130個(gè)途徑，其中21個(gè)途徑差異顯著。篩選得到的葉綠素合成途徑（ko00860）、天線蛋白（ko00196）和光合作用途徑（ko00195）的基因表達(dá)對(duì)比分析，結(jié)果表明這3個(gè)途徑的基因普遍顯著下調(diào)表達(dá)?！窘Y(jié)論】初步探索了多肉植物錦化變異的轉(zhuǎn)錄組信息，篩選到表達(dá)差異顯著的基因及途徑，為進(jìn)一步研究多肉植物錦化變異機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多肉植物;錦化突變;轉(zhuǎn)錄組;光合作用

中圖分類號(hào)：Q 943.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）02-176-08

0 引言

【研究意義】 多肉植物是莖、葉特別粗大或肥厚，含水量高，并在干旱環(huán)境中有長(zhǎng)期生存力的一類植物。由于其品種多樣、極具個(gè)性、栽培簡(jiǎn)易，因而近幾年深受廣泛喜愛(ài)，消費(fèi)需求快速增長(zhǎng)，推動(dòng)了國(guó)內(nèi)多肉植物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。其中百合科Liliaceae瓦葦屬Haworthia植物是多年生多肉類常綠草本，全屬約有150余個(gè)種，世界各地廣泛分布。瓦葦屬植物葉呈披針形三角狀，肉質(zhì)厚實(shí)表面光滑革質(zhì)有光澤，葉色淺綠，葉上有彩色條紋或彩色星狀斑點(diǎn)，十分美麗，具有極高的觀賞價(jià)值，深受多肉愛(ài)好者的追捧[2-3]。常作盆栽植物觀賞，極適宜居室、廳堂、陽(yáng)臺(tái)擺放裝飾，具有清新優(yōu)雅之美[4]。多肉的葉、莖等部位在生長(zhǎng)過(guò)程中色素發(fā)生缺失或變異，會(huì)造成該部位出現(xiàn)黃色、白色、橙色、紅色斑紋或斑塊。這種“斑錦變異”現(xiàn)象實(shí)質(zhì)上是植物的一種病態(tài)，但在植物中，這種病態(tài)卻有著另類的美。因其植株體內(nèi)含有色素較少，生長(zhǎng)緩慢，較為珍貴，某些斑錦品種的價(jià)格往往是原種的數(shù)倍、數(shù)十倍，甚至上百倍[5-6]。因此研究多肉植物的“斑錦變異”具有較高的市場(chǎng)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 多肉“斑錦變異”的本質(zhì)是葉綠素的缺失，目前對(duì)植物組織中葉綠素含量測(cè)量方法已經(jīng)得到廣泛使用及發(fā)展，如理化測(cè)量、接觸式測(cè)量、非接觸式測(cè)量等，每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，需根據(jù)實(shí)際情況選擇 [7]。其中用分光光度計(jì)法測(cè)定樣品中葉綠素和類胡蘿卜素含量是較為傳統(tǒng)、被廣泛認(rèn)可的使用方法[8-10]。目前葉綠素合成途徑已廣為人知，有研究報(bào)道，光照和植物內(nèi)源激素互作共同調(diào)控?cái)M南芥種苗中葉綠素生物合成[11-12]。而且模式植物中相應(yīng)分子調(diào)控機(jī)制初步建立[13-14]。因此，筆者在此基礎(chǔ)上對(duì)葉綠素合成缺陷突變體進(jìn)一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 目前由于對(duì)多肉植物錦化變異分子機(jī)理研究甚少，其錦化變異過(guò)程中基因表達(dá)差異尚無(wú)報(bào)道，是否存在關(guān)鍵基因起作用等問(wèn)題值得探索?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)日益成熟，成為研究多肉錦化變異的重要工具[15-18]。本研究以青蟹壽Haworthia magnifica及全錦突變體qj為研究對(duì)象，檢測(cè)并分析其葉綠素及類胡蘿卜素含量差異，并利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選分析差異表達(dá)的基因及途徑，為后續(xù)錦化變異的分子機(jī)理研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以高3 cm的青蟹壽及全錦突變體葉片為材料（圖1-A），野生型為WT，突變體命名為qj。

1.2 儀器和藥品

CaCO3、石英砂和異丙醇試劑購(gòu)于西隴化工股份有限公司;濾紙購(gòu)于杭州富陽(yáng)北木漿紙有限公司;無(wú)水乙醇購(gòu)于達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司;Trizol裂解液購(gòu)于Invitrogen;

高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：1-14K）購(gòu)于Sigma;微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000）購(gòu)于賽默飛;可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)：V-1200）購(gòu)于上海美譜達(dá)。

1.3 葉綠素和類胡蘿卜素含量測(cè)定

用分光光度計(jì)法測(cè)定樣品中葉綠素和類胡蘿卜素含量[19]。具體方法：稱取新鮮葉片2.0 g置于研缽中，加入0.5 g的CaCO3和0.5 g石英砂及2 mL 96%乙醇研磨勻漿，再加入96%乙醇10 mL繼續(xù)研磨至組織成白色。取濾紙一張，放入漏斗中用96%乙醇潤(rùn)濕，把提取液倒入漏斗中，濾液用25 mL量瓶收集，用少量96%乙醇沖洗研缽數(shù)次，最后連殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。用滴管吸?6%乙醇將濾紙上的葉綠素提取液全部洗入量瓶?jī)?nèi)，直至濾紙和殘?jiān)鼮闊o(wú)綠色。最后用96%乙醇定容至25 mL。將葉綠素提取液倒入光徑1 cm的比色杯內(nèi)，用分光光度計(jì)分別在波長(zhǎng)665、649和470 nm下測(cè)定吸光度。根據(jù)公式分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量：Ca=13.95×A665-6.88×A649; Cb=24.96×A649-7.32×A665; C=（1000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb）/245。

1.4 RNA提取與文庫(kù)構(gòu)建

采用常規(guī)Trizol法提取材料RNA。具體方法：往研缽中加入適量液氮和2.0 g新鮮植物材料，充分研磨至粉末并收集，往粉末加入1 mL Trizol裂解液，用渦旋器充分混勻，使樣品充分裂解，混勻后放置搖床中，搖8 min左右。加入200 μL氯仿蕩搖勻，4℃ 12 000 r·min-1離心10 min。取上清液加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，-20℃沉淀過(guò)夜。4℃ 12 000 r·min-1離心15 min。棄上清，加0.5 mL 75%乙醇，洗滌沉淀，重復(fù)1次。4℃ 8 000～10 000 r·min-1離心5 min（小心倒出上清）。短暫離心，用移液槍吸干乙醇，真空干燥2 min。加30 μL ddH2O，室溫溶解5 min，混勻后短暫離心。微量分光光度計(jì)（Nanodrop 2000）檢測(cè)濃度。-80℃冰箱保存樣品。

cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。通過(guò)Illumina Hiseq 4000測(cè)序平臺(tái)，得到原始讀序（Raw reads），經(jīng)過(guò)濾去除部分低質(zhì)量序列和adapters得到干凈讀序（Clean reads）。然后借助Trinity 軟件根據(jù)序列之間的重疊信息組裝得到Unigenes。

1.5 基因表達(dá)量計(jì)算、注釋、分類和途徑分析

通過(guò)RPKM（Reads Per kb Million reads）值計(jì)算定量Unigenes的表達(dá)，公式為RPKM=106×C/（N×L/1 000），C為匹配到某個(gè)Unigene的reads數(shù)，N為能匹配到所有Unigene的reads總數(shù)，L為該Unigene的堿基數(shù)。并且以FDR<0.05且|log2FC|>1篩選差異基因。通過(guò)BLASTx程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）以e-value<1e-5為閾值在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.expasy.ch/sprot）、KEGG）、Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp/kegg）和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）對(duì)Unigenes注釋?；贜r注釋，借助Blast2GO軟件對(duì)GO注釋分析[20]。然后通過(guò)WEGO軟件對(duì)Unigene分類[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量比較

通過(guò)分光光度計(jì)法測(cè)得WT葉綠素a、b和類胡蘿卜素平均含量分別為0.178、0.097、0.049 mg·g-1;然而qj對(duì)應(yīng)含量?jī)H為0.003、0.003、0.002 mg·g-1，分別降低了98.56%、96.74%、95.66%。顯著性差異分析表明突變體中葉綠素a、b含量極顯著降低，類胡蘿卜素顯著降低（圖1），突變體中幾乎無(wú)葉綠素a、b和類胡蘿卜素積累。由于野生型與突變體均在相同的環(huán)境中萌芽及生長(zhǎng)，顯示這極有可能與色素合成途徑的基因表達(dá)差異相關(guān)。2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與序列拼接

對(duì)野生型和突變體cDNA文庫(kù)測(cè)序，分別獲得Raw Reads數(shù)44 988 938和37 271 576，過(guò)濾后Clean Reads數(shù)分別為43 871 136（97.52%）和36 263 612（97.30%），Q20值分別為98.38%和98.35%，Q30值分別為94.88%和94.82%，G+C含量分別為49.52%和48.86%（表1）。表明測(cè)序結(jié)果良好。

借助trinity軟件對(duì)濾后序列進(jìn)行Denovo拼接，共獲得45 226條Unigene，最長(zhǎng)為16 566 bp，最短為201 bp，平均長(zhǎng)度為875 bp，N50為1 507 bp。表明拼接結(jié)果良好（圖2）。

2.3 Unigene功能注釋與分類

使用Blast將Unigene與Nr、Swiss-prot、KEGG和KOG四大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共注釋27 474條Unigene（圖3-A）。GO功能分類體系中共有2 975條Unigene被注釋到，被分配到GO條目下14 233次，可分為生物過(guò)程（6226）、分子功能（3069）、細(xì)胞組分（4911）三大類下40個(gè)功能（圖3-B）。在KOG注釋中，有16 943條Unigene被分配到KOG條目下25個(gè)功能類別28 761次（圖3-C）。表明注釋分類結(jié)果良好。

2.4 差異表達(dá)基因分類富集分析

以FDR<0.05且|log2FC|>1為閾值篩選差異顯著基因，獲得20 305條（44.90%）差異顯著Unigene，其中9 176條（45.19%）Unigene顯著上調(diào)，樣品相關(guān)性為0.428 1（圖4-A）。

差異顯著基因GO富集分析結(jié)果表明差異基因GO功能分類體系下生物過(guò)程（3123）、分子功能（1546）、細(xì)胞組分（2724），上下調(diào)Unigene排名前10依次為：代謝過(guò)程（885）、催化活性（815）、細(xì)胞過(guò)程（730）、細(xì)胞（616）、細(xì)胞組分（616）、單有機(jī)體過(guò)程（595）、結(jié)合（549）、細(xì)胞器（448）、細(xì)胞質(zhì)膜（283）、細(xì)胞器組分（228）（圖4-B）。顯示qj差異主要表現(xiàn)在代謝過(guò)程、酶促反應(yīng)及細(xì)胞組分。

對(duì)顯著差異基因KEGG富集分析表明光合作用途徑（ko00195）差異最顯著（Pvalue和Qvalue均為0）且富集程度較高（Rich factor =0.87）。此外，Pvalue和Qvalue均<0.05的差異顯著pathway共有21個(gè)，其中有淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、戊糖與 轉(zhuǎn)換（ko00040）、脂肪酸合成（ko00061）、類黃酮合成（ko00941）、天線蛋白（ko00196）、二萜生物合成（ko00904）、脂肪酸代謝（ko01212）、泛醌和其他萜類化合物-醌生物合成（ko00130）等。顯示了這些差異極有可能是由光合作用途徑（ko00195）作為關(guān)鍵途徑主導(dǎo)其他途徑基因的差異表達(dá)。

2.5 光合作用相關(guān)差異基因表達(dá)分析

對(duì)光合作用途徑基因表達(dá)分析表明該途徑上的63個(gè)基因有46個(gè)表達(dá)差異顯著，且均表達(dá)下調(diào)，涉及光系統(tǒng)I（13/16）、光系統(tǒng)II（17/27）、細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體（5/8）、光合作用電子傳遞鏈（4/4）、F型ATP酶（7/8）。其中|log2FC|≥2（即表達(dá)下調(diào)4倍以上）的基因有41個(gè)（89.13%），|log2FC|≥3（即表達(dá)下調(diào)8倍以上）的基因有33個(gè)（71.73%），其中的petD、psbT、psb28下調(diào)最為明顯（圖5）。qj光系統(tǒng)中基因普遍顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明qj光合效率下降顯著。

對(duì)光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的天線蛋白的基因表達(dá)分析表明天線蛋白涉及的12個(gè)基因有11個(gè)（lchb7除外）表達(dá)顯著下調(diào)，且下調(diào)程度顯著，這11個(gè)基因的|log2FC|均≥3（圖6）。qj天線蛋白基因普遍顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明qj在光合作用時(shí)捕光能力顯著下降，這與葉綠素含量顯著下降正相關(guān)。

對(duì)葉綠素合成途徑的酶基因表達(dá)分析表明該途徑17個(gè)基因有16個(gè)下調(diào)表達(dá)（hemD未檢測(cè)到），其中|log2FC|>1的有15個(gè)（hemB除外），|log2FC|≥2的基因有12個(gè)（70.58%）（圖7）。qj的葉綠素合成途徑酶基因普遍顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明了葉綠素合成酶含量顯著降低，這也解釋了突變體中葉綠素含量顯著降低。

3 討論與結(jié)論

本研究以多肉植物青蟹壽為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)分光光度計(jì)法表明突變體qj葉綠素a、b和類胡蘿卜含量均極顯著降低。借助高通量測(cè)序，從WT及qj轉(zhuǎn)錄組測(cè)序庫(kù)中分別獲得44 988 938和37 271 576 條Reads，Q30值分別為94.88%和94.82%，G+C含量分別為49.52%和48.86%，表明測(cè)序結(jié)果良好;經(jīng)過(guò)濾拼接組裝出45 226條Unigene，最長(zhǎng)為16 566 bp，最短為201 bp，平均長(zhǎng)度為875 bp，N50為1 507 bp，拼接結(jié)果良好;所得Unigene注釋Nr分類中26 999條，Swissport注釋為20 279條，KOG注釋為16 943條，KEGG注釋為10 775條，注釋分類結(jié)果良好。

篩選獲得差異Unigene共20 305條，涉及130個(gè)途徑，其中21個(gè)途徑差異顯著，包含了葉綠素合成、天線蛋白和光合作用3個(gè)途徑，其余18個(gè)途徑的基因表達(dá)差異不一致。進(jìn)一步分析3個(gè)途徑基因表達(dá)，結(jié)果表明光合作用途徑的63個(gè)基因有46個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào);天線蛋白的12個(gè)基因有11個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào);葉綠素合成途徑的17個(gè)酶基因有16個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。因此，qj的葉綠素合成、天線蛋白含量、光合作用相關(guān)蛋白含量顯著降低，進(jìn)而降低qj的光合作用能力，并以此作為關(guān)鍵，最終影響其他基因的表達(dá)。然而，影響這3個(gè)途徑基因的相關(guān)因素有待進(jìn)一步研究，可能存在某個(gè)或某些關(guān)鍵因子起重要作用，也可能與某些基因的DNA甲基化有關(guān)，這些均值得進(jìn)一步研究。

本研究初步探索瓦葦屬錦化變異的轉(zhuǎn)錄組信息，篩選并分析表達(dá)差異顯著的基因及途徑，為進(jìn)一步研究多肉植物錦化變異機(jī)制提供了基礎(chǔ)。但由于該機(jī)理復(fù)雜，受影響潛在因子眾多，相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（責(zé)任編輯：黃愛(ài)萍）