溫正輝 凌梅娣 余思萍 莊遠(yuǎn)杯 羅曉東 潘增烽 林大都 張聲源

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）23-3246-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.14

摘 要 目的：比較蒲桃不同藥用部位（根、莖、葉、種子、花和果肉）乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性的抑制作用。方法：以半數(shù)抑制濃度（IC50）為評價指標(biāo)，阿卡波糖為陽性對照，采用體外抑制模型方法評價蒲桃不同藥用部位乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶（酵母菌源和小鼠小腸源）和α-淀粉酶活性的抑制作用，并采用酶促動力學(xué)與Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法分析作用最強的藥用部位對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制類型。結(jié)果：蒲桃不同藥用部位乙醇提取物對酵母菌源α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的強弱順序為蒲桃種子>蒲桃莖>蒲桃葉>蒲桃根>蒲桃花>蒲桃果肉>阿卡波糖，對小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的強弱順序為蒲桃種子>蒲桃莖>蒲桃根>蒲桃葉>蒲桃花>蒲桃果肉>阿卡波糖，對α-淀粉酶活性抑制作用的強弱順序為阿卡波糖>蒲桃種子>蒲桃莖>蒲桃根>蒲桃葉>蒲桃果肉>蒲桃花。其中，蒲桃種子乙醇提取物對酵母菌源α-葡萄糖苷酶、小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用[IC50分別為（6.64±0.24）、（32.77±2.46）和（41.18±1.63） μg/mL]顯著強于其他藥用部位，并且對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著強于阿卡波糖[對酵母菌源α-葡萄糖苷酶和小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶的IC50分別為（2 833.33±5.48）、（1 304.21±6.45） μg/mL]（P<0.05），但其對α-淀粉酶活性的抑制作用不及阿卡波糖[IC50為（27.27±1.24） ? ? ? μg/mL]（P<0.05）。酶促動力學(xué)研究結(jié)果表明，蒲桃種子乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用均為可逆競爭性抑制類型。結(jié)論：在蒲桃根、莖、葉、種子、花和果肉等不同部位中，以蒲桃種子對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性的抑制作用最強，具有開發(fā)成輔助降糖的藥品或保健食品的價值。

關(guān)鍵詞 蒲桃;藥用部位;乙醇提取物;α-葡萄糖苷酶;α-淀粉酶;酶促動力學(xué)

Study on Inhibitory Effects of Ethanol Extract of Different Medicinal Parts from Syzygium jambos on the Activities of α-Glycosidase and α-Amylase

WEN Zhenghui1，LING Meidi2，YU Siping2，ZHUANG Yuanbei2，3，LUO Xiaodong2，PAN Zengfeng2，LIN Dadu2，ZHANG Shengyuan2，3（1.Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Medical College， Jiaying University， Guangdong Meizhou 514031， China;2.Medical College， Jiaying University， Guangdong Meizhou 514031， China;3.Institute of Hakka Medicinal Bio-resources， Medical College， Jiaying University， Guangdong Meizhou 514031， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To compare inhibitory effects of ethanol extract of different medicinal parts （root， stem， leaf， seed， flower and flesh） from Syzygium jambos on the activities of α-glycosidase and α-amylase. METHODS： Using half-inhibitory concentration value （IC50） as evaluation index， acarbose as positive control， inhibitory effects of ethanol extract of different medicinal parts from S. jambos on the activities of α-glycosidase （from yeast and small instestine in mice） and α-amylase were evaluated with in vitro inhibition model. The enzymatic dynamics and Lineweaver-Burk methods were used to analyze the inhibitory type of the best medicinal part on the activities of α-glycosidase and α-amylase. RESULTS： In the yeast α-glucosidase inhibitory activity test， the order of inhibitory activity was S. jambos seed>S. jambos stem>S. jambos leaf>S. jambos root>S. jambos flower>S. jambos flesh>acarbose. In the mice intestine α-glucosidase inhibitory activity test， the order of inhibitory activity was S. jambos seed>S. jambos stem>S. jambos root>S. jambos leaf>S. jambos flower>S. jambos flesh>acarbose. In the α-amylase inhibitory activity test， the order of inhibitory activity was acarbose>S. jambos seed>S. jambos stem>S. jambos root>S. jambos leaf>S. jambos flesh>S. jambos flower. Ethanol extract of S. jambos seed had the stronger inhibition activity against α-glucosidase from yeast，α-glucosidase from small intestine in mice and α-amylase than other medicinal parts [IC50 were（6.64±0.24）， （32.77±2.46） and （41.18±1.63） μg/mL]. Ethanol extract of S. jambos seed had the stronger inhibition activity against α-glucosidase than acarbose [IC50 to α-glucosidase from yeast and α-glucosidase from small intestine in mice were （2 833.33±5.48）， （1 304.21±6.45） μg/mL] （P<0.05）. The inhibitory effect of ethanol extract from S. jambos on the activity of α-amylase was less than that of acarbose [IC50 was （27.27±1.24） μg/mL] （P<0.05）. Enzymatic dynamics showed that the inhibitory type of ethanol extract from S. jambos seed on α-glucosidase and α-amylase were both reversible competitive inhibition. CONCLUSIONS： Among different parts of S. jambos such as root， stem， leaf， seed， flower and flesh， S. jambos seed shows the strongest inhibitory effects on the activities of α-glucosidase and α-amylase， which has the value of being developed for the treatment of diabetes or health food.

KEYWORDS Syzygium jambos; Medicinal part; Ethanol extract; α-glucosidase; α-amylase; Enzymatic dynamics

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）在臨床上主要有胰島素依賴型（1型，T1DM） 和非胰島素依賴型（2型，T2DM），其中 T2DM 患者胰島素分泌不足及分泌高峰延遲，餐后血糖持續(xù)升高，是引起腎病、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥的主要原因，有效控制餐后血糖上升有利于防治糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[1]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是碳水化合物消化為葡萄糖的關(guān)鍵酶，為降低餐后血糖的有效分子靶標(biāo)[2-3]。已上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如阿卡波糖、伏格列波糖等已被推薦為臨床降低餐后血糖的首選藥物，但長期服藥會引發(fā)腸胃脹氣、腹部不適等不良反應(yīng)，并且有可能使機體產(chǎn)生依賴性[4-5]。從中草藥資源中尋找新型、高效、低毒的α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為糖尿病治療藥物的研究熱點和開發(fā)方向。

蒲桃[Syzygium jambos （L.） Alston]為桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃屬常綠喬木，在我國主產(chǎn)于廣東、海南等省區(qū)，為嶺南地區(qū)民間習(xí)用藥材，已收載于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中[6]。蒲桃藥用歷史悠久，據(jù)《中華本草》[7]記載，蒲桃根皮具有涼血解毒功效，主治泄瀉、外傷出血;蒲桃莖具有溫中散寒、溫肺止咳等功效，用于胃寒呃逆、肺虛寒咳;蒲桃葉可以清熱解毒，主治瘡瘍、痘瘡;蒲桃種子可以健脾止瀉，主治脾虛泄瀉、糖尿病;蒲桃殼可以暖胃健脾、補肺止嗽，主治胃寒呃逆、肺虛寒嗽。本課題組前期對蒲桃枝葉開展了降血糖活性成分研究，發(fā)現(xiàn)蒲桃枝葉的乙酸乙酯和正丁醇提取物及從中分離得到的多個成分具有良好的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性[8]。為進(jìn)一步全面比較蒲桃不同藥用部分在降血糖方面的藥效作用，本研究擬對蒲桃的根、莖、葉、種子、花和果肉6個藥用部位的乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的體外抑制作用進(jìn)行評價，并對活性最強藥用部位進(jìn)行酶促動力學(xué)分析，為擴大蒲桃藥用部位及其資源的綜合利用提供更充分的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Alliance 2695型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）;UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）;Q-Gard A2型超純水儀（德國Millipore公司）;BT125D型電子分析天平、BS110s 型電子分析天平（德國Sartorius公司）;TG16-WS 型高速離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）;JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）;PHSJ-3F型pH計（上海精科儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

蒲桃的種子、莖、葉、根、花、果肉于2017年5月采自廣東省梅州市梅江區(qū)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系聶華副教授鑒定為真品;α-葡萄糖苷酶（面包酵母，批號：SLBT8587，活性：≥10 U/mg）、α-淀粉酶（批號：SLBV0705，活性：≥10 U/mg）均購自美國Sigma 公司;對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，上海源葉科技有限公司，批號：K04F8B28175，純度：99%，生物技術(shù)級）;阿卡波糖片（德國拜耳公司，批號：BJ41706，規(guī)格：50 mg）;3，5二硝基水楊酸（DNS，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20170904，分析純）;可溶性淀粉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20180501，分析純）;甲醇和乙腈（美國Fisher Scientific公司，色譜純）;其他試劑均為分析純。

1.3 動物

健康昆明種小鼠80只，♂，體質(zhì)量18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK-（粵）2018-0002。實驗前將小鼠飼養(yǎng)于相對濕度為45%～75%、室溫為25 ℃的動物室內(nèi)，飼養(yǎng)期間自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。本研究得到嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，在整個實驗中遵守《實驗動物管理條例》，做到減輕小鼠痛苦，增加其舒適度。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒲桃不同藥用部位乙醇提取物的制備

分別取蒲桃種子、莖、葉、根、花和果肉各2.0 kg，干燥，粉碎過40目，分別用2倍量的95%乙醇超聲（45 ℃，200 W，40 kHz，30 min）提取3次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，即得到種子浸膏169 g（得率為8.5%）、莖浸膏217 g（得率為10.9%）、葉浸膏324 g（得率為16.2%）、根浸膏224 g（得率為11.2%）、花浸膏198 g（得率為9.9%）、果肉浸膏248 g（得率為12.4%），將各部位浸膏放置于4 ℃冷藏，備用。樣品使用前加磷酸鹽緩沖液（PBS，0.067 mol/L、pH 6.8）溶解，制備成不同質(zhì)量濃度的溶液（質(zhì)量濃度均以提取物計）。

2.2 對酵母菌來源α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

采用pNPG法進(jìn)行試驗，檢測方法采用HPLC法。色譜條件：色譜柱為XBridge Peptide BEH C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，20%→30%A;8～13 min，30%→80%A;13～15 min，80%→20% A;15～25 min，20%A）;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;柱溫為35 ℃;檢測波長為315 nm。

試驗以pNPG為底物，通過HPLC檢測產(chǎn)物對硝基苯酚 （pNP） 的變化，確定α-葡萄糖苷酶的活性。參考文獻(xiàn)方法[8]并作適當(dāng)調(diào)整，具體如下：將蒲桃各部位樣品（根、莖、葉、種子、花和果肉的乙醇提取物浸膏）分別制備成不同質(zhì)量濃度的溶液，其中，根部位樣品為18、24、30、36、42 μg/mL，莖部位樣品為14、17.5、21、24.5、28 ? ? ?μg/mL，葉部位樣品為10、15、25、35、45 μg/mL，種子部位樣品為3.5、5.25、7、10.5、12.25 μg/mL，花部位樣品為10、20、30、50、70 μg/mL，果肉部位樣品為2 400、2 800、 ? ? ?3 200、3 600、4 000 μg/mL;將阿卡波糖（陽性對照）制備成質(zhì)量濃度分別為500、1 000、2 000、3 000、4 000 μg/mL的溶液。將0.067 mol/L pH 6.8的PBS 500 μL、待測樣品100 μL和0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶（0.067 mol/L pH 6.8的PBS溶解）600 μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫孵育20 min，加入4.0 mmol/L的pNPG 400 μL，振蕩混勻，在37 ℃恒溫反應(yīng)30 min后，加入甲醇1 600 μL終止反應(yīng);樣品經(jīng)0.45 μm膜過濾后，用HPLC法檢測pNP峰面積（A）。按以下公式計算抑制率：抑制率（%）=[1-（A樣品-A樣品對照）/A陰性]×100%，式中，A陰性表示在相同條件下以等體積PBS代替樣品測得的pNP峰面積，A樣品對照表示在相同條件下以等體積PBS代替α-葡萄糖苷酶測得的pNP峰面積。試驗重復(fù)3次，采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，使用PROBIT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析、處理，得到相應(yīng)的酶半數(shù)抑制濃度 （IC50）;多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。蒲桃不同藥用部位乙醇提取物對酵母菌來源α-葡萄糖苷酶的IC50測定結(jié)果見表1。

表1結(jié)果顯示，蒲桃各藥用部位乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用。蒲桃不同藥用部位對酵母菌源α-葡萄糖苷酶抑制作用強弱依次為：種子>莖>葉>根>花>果肉，各藥用部位的IC50均顯著低于陽性對照阿卡波糖[IC50=（2 833.33±5.48） μg/mL]，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 對小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

采用pNPG法進(jìn)行試驗。參照文獻(xiàn)方法[9]并作適當(dāng)調(diào)整，具體如下：將80只小鼠經(jīng)頸椎脫位方法處死，獲得小鼠小腸。采用預(yù)冷的0.9% NaCl溶液清洗腸道脂肪組織，并縱向切開洗凈內(nèi)容物，按體積比為1 ∶ 3加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鈉緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0），混合物研磨后于4 ℃下以8 000 r/mim離心20 min，吸取上清液后分裝，即得小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶，-20 ℃貯存，備用。將各樣品（根、莖、葉、種子、花和果肉的乙醇提取物浸膏）制備成不同質(zhì)量濃度的溶液，其中，根部位樣品為500、1 500、2 500、3 500、4 500 μg/mL，莖部位樣品為80、240、400、560、720 μg/mL，葉部位樣品為500、1 500、 ? ? ?2 500、3 500、4 500 μg/mL，種子部位樣品為80、240、400、560、720 μg/mL，花部位樣品為500、1 500、2 500、 ? ?3 500、4 500 μg/mL，果肉部位樣品為500、1 500、2 500、3 500、4 500 μg/mL;另外，將阿卡波糖（陽性對照）制備成質(zhì)量濃度分別為500、1 500、2 500、3 500、4 500 μg/mL的溶液。α-葡萄糖苷酶抑制活性測定及檢測方法、樣品的加入和處理以及抑制率的計算方式以及統(tǒng)計分析等均同“2.2”項下。蒲桃不同藥用部位乙醇提取物對小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶的IC50測定結(jié)果見表2。

表2結(jié)果顯示，蒲桃各藥用部位乙醇提取物對小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用。且在試驗濃度范圍內(nèi)，其對小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制作用強弱依次為：種子>莖>根>葉>花>果肉，各藥用部位的IC50均顯著低于陽性對照阿卡波糖[IC50= ? （1 304.21±6.45） μg/mL]，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 對豬胰腺α-淀粉酶抑制率的測定

采用DNS法。參考文獻(xiàn)方法[10]并作適當(dāng)調(diào)整，具體如下：將各樣品（根、莖、葉、種子、花和果肉的乙醇提取物浸膏）制備成不同質(zhì)量濃度的溶液，根部位樣品為31、62.25、125、250、500 μg/mL，莖部位樣品為31、62.25、125、250、500 μg/mL，葉部位樣品為2 500、5 000、10 000、15 000、20 000 μg/mL，種子部位樣品為3、12、48、192、384 μg/mL，花部位樣品為2 500、5 000、10 000、15 000、20 000 μg/mL，果肉部位樣品為2 500、5 000、10 000、 ?15 000、20 000 μg/mL;將阿卡波糖（陽性對照）制備成質(zhì)量濃度分別為0.1、1、10、100、200 μg/mL的溶液。吸取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.3 mL，分別置于10 mL試管中，取0.686 mg/mL α-淀粉酶溶液0.3 mL分別與樣品混合均勻，置于37 ℃水浴中預(yù)溫5 min，加入0.3 mL在 37 ℃水浴中同時預(yù)溫5 min的1%可溶性淀粉溶液，混勻后反應(yīng)15 min，立即加入0.5 mL DNS顯色并終止反應(yīng)，置于沸水中煮沸5 min，隨后放置于冰水中靜置20 min，磷酸緩沖溶液定容至5 mL，采用紫外-可見分光光度計在540 nm波長下測溶液吸光值（A）。并按公式計算各其對α-淀粉酶的抑制率：抑制率（%）=[1-（A樣品-A樣品對照）/（A陰性-A陰性對照）]×100%，式中，A陰性為在相同條件下以等體積PBS替代樣品測得的吸光度值，A陰性對照為在相同條件下分別以等體積PBS替代樣品和α-淀粉酶測得的吸光度值，A樣品對照為在相同條件下以等體積PBS替代α-淀粉酶測得的吸光度值。試驗重復(fù)3次，統(tǒng)計分析方法同“2.2”項下。蒲桃不同藥用部位乙醇提取物對α-淀粉酶的IC50測定結(jié)果見表3。

表3結(jié)果顯示，蒲桃各藥用部位乙醇提取物對α-淀粉酶活性均有一定的抑制作用。其對α-淀粉酶抑制作用強弱小依次為：種子>莖>根>葉>果肉>花，各藥用部位的IC50均顯著高于陽性對照阿卡波糖[IC50=（27.27±1.24） μg/mL]，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)試驗

由于蒲桃種子乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著強于其他藥用部位，因此本研究選用蒲桃種子乙醇提取物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)試驗。參考文獻(xiàn)方法[11-12]并作適當(dāng)調(diào)整，具體如下：固定底物pNPG濃度為4.0 mmol/L，在不添加（0 μg/mL）和添加蒲桃種子乙醇提取物（質(zhì)量濃度為3.0、6.0 μg/mL，以乙醇提取物計，下同）的條件下，分別測定其在不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 U/mL）α-葡萄糖苷酶反應(yīng)體系下的反應(yīng)初速率，以酶濃度（U/mL）為橫坐標(biāo)、反應(yīng)初速率mmol/（L·min）為縱坐標(biāo)作圖，判斷其為可逆或不可逆抑制類型，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，3組直線通過原點，且直線的斜率隨蒲桃種子質(zhì)量濃度的減小而減小，為典型的可逆性抑制特征圖。結(jié)果表明，蒲桃種子乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為可逆性抑制。

在確定其為可逆抑制類型的情況下，固定α-葡萄糖苷酶濃度為0.1 U/mL，在不添加（0 μg/mL）和添加蒲桃種子醇提物（質(zhì)量濃度為3.0、6.0 μg/mL）的條件下，測定其在不同pNPG濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L）反應(yīng)體系下的反應(yīng)初速率，以底物濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標(biāo)和反應(yīng)初速率的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk曲線，以判斷其屬于競爭性抑制類型還是非競爭性抑制類型，結(jié)果詳見圖2。

由圖2可知，3組直線均交于縱軸，即反應(yīng)速率Vmax不變，為0.016 15 （L·min）/mmoL;斜率（米氏常數(shù)Km）隨蒲桃種子醇提物質(zhì)量濃度的增大而增大，為典型的競爭性抑制類型。結(jié)果提示，蒲桃種子乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用為可逆競爭性抑制。

2.6 對α-淀粉酶抑制作用的動力學(xué)試驗

由于蒲桃種子對α-淀粉酶抑制作用顯著強于其他藥用部位，因此本研究選用蒲桃種子進(jìn)行α-淀粉酶抑制作用的動力學(xué)試驗。參考文獻(xiàn)方法[13]并作適當(dāng)調(diào)整，具體如下：固定淀粉酶濃度為1.0%，在不添加（0 μg/mL）和添加蒲桃種子乙醇提取物（質(zhì)量濃度為40.0、80.0 ? ? ? μg/mL）的條件下，分別測定其在不同α-淀粉酶質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）反應(yīng)體系下的反應(yīng)初速率，以α-淀粉酶質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、反應(yīng)初速率mg/（L·min）為縱坐標(biāo)作圖，判斷其可逆或不可逆抑制類型，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，3組直線均通過原點，且直線的斜率隨蒲桃種子乙醇提取物質(zhì)量濃度的減小而減小，表明蒲桃種子乙醇提取物對α-淀粉酶的抑制類型為可逆性抑制。

在確定其為可逆抑制類型的情況下，固定α-淀粉酶質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL，在不添加（0 μg/mL）和添加蒲桃種子乙醇提取物（質(zhì)量濃度為40.0、80.0 μg/mL）的條件下，測定其在不同α-淀粉酶溶液質(zhì)量濃度（0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL）反應(yīng)體系下的反應(yīng)初速率，以底物α-淀粉酶濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標(biāo)、反應(yīng)初速率的倒數(shù) ? ?（1/V）為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk曲線，判斷其屬于競爭性抑制類型還是非競爭性抑制類型，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，3組直線均交于縱軸，即反應(yīng)速率Vmax不變，為0.056 （L·min）/mg;斜率（米氏常數(shù)Km）隨抑制劑質(zhì)量濃度的增大而增大，為典型的競爭性抑制類型。結(jié)果表明，蒲桃種子乙醇提取物對α-淀粉酶抑制作用為可逆競爭性抑制。

3 討論

我國蒲桃資源較為豐富，其中蒲桃種子民間用于防治糖尿病的藥用基礎(chǔ)深厚，但對蒲桃種子以及蒲桃其他藥用部位在抗糖尿病方面的現(xiàn)代藥學(xué)研究還處于起步階段，其民間藥用科學(xué)內(nèi)涵不明確[14]。然而，國內(nèi)外學(xué)者對其同屬植物海南蒲桃（S. hainanense）進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)海南蒲桃具有顯著的降血糖活性，并從中分離得到一系列降血糖活性成分[15-16]。此外，由著名的植物藥公司（意大利Indena公司）研發(fā)的一種降血糖專利藥物Madeglucyi的主要成分即為海南蒲桃籽提取物[17]。以上研究均提示，蒲桃也有可能存在相似甚至更為豐富的藥效物質(zhì)和生理活性。此外，基于HPLC的α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測方法是一種更為有效且新穎的方法，可通過調(diào)整保留時間將酶促反應(yīng)產(chǎn)物pNP所對應(yīng)的色譜峰與藥材提取物所含成分對應(yīng)的色譜峰分開，有效避免藥物本身對反應(yīng)結(jié)果的影響，避免假陽性的發(fā)生，較于傳統(tǒng)的紫外分光光度法，試驗結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠[18]。

本研究采用基于HPLC的α-淀粉酶、酵母源α-葡萄糖苷酶和小鼠小腸源α-葡萄糖苷酶體外篩選模型，分別對蒲桃的根、莖、葉、種子、花和果肉6個不同藥用部位乙醇提取物的酶抑制活性進(jìn)行了評價。試驗結(jié)果顯示，蒲桃不同藥用部位乙醇提取物均有不同程度的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性。從整體上看，蒲桃種子表現(xiàn)出較強的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，且明顯強于蒲桃其他藥用部位（P<0.05），其中對α-葡萄糖苷酶抑制活性優(yōu)于陽性對照阿卡波糖，對α-淀粉酶抑制活性弱于陽性對照，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。同時，試驗選取酶抑制活性最強的蒲桃種子乙醇提取物進(jìn)行了酶促動力學(xué)分析。結(jié)果表明，蒲桃種子對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制類型均為可逆的競爭性抑制。

前期在對蒲桃不同藥用部位乙醇提取物抑制酶活性的預(yù)試驗過程中發(fā)現(xiàn)，不同藥用部位抑制酶活性的質(zhì)量濃度范圍差異較大，如種子乙醇提取物在12.25 μg/mL時抑制率已達(dá)到98.46%，而果肉乙醇提取物在質(zhì)量濃度為2 400 μg/mL時抑制率僅為51.19%。通過考察不同藥用部位抑制率在0～100%的質(zhì)量濃度范圍后，最終確定本研究中各部位樣品的質(zhì)量濃度。另外，試驗結(jié)果顯示蒲桃各藥用部位乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用優(yōu)于陽性對照阿卡波糖，但在體內(nèi)實驗中蒲桃提取物是否具有同樣的藥效及以其具體的藥效成分和作用機制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究探索性研究了蒲桃各藥用部位乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)蒲桃各部位特別是種子具有良好的降血糖作用，這為蒲桃擴大藥用部位及其資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-05-05 修回日期：2019-08-29）

（編輯：林 靜）