方 慧，魯長俊，呂 悅，鄭珊嬌，俞婷婷，王 寅，鄭 英（.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇三醫(yī)院，浙江 杭州 3003；.河南省直第三人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

酒精性肝病是影響人類健康的重要問題，短時間內(nèi)乙醇的大量攝入可導(dǎo)致肝臟發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，即急性酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）。目前對于急性酒精性肝病治療沒有特效的藥物，因此，加強對酒精性肝病病因的研究和防治是當(dāng)前面臨的重要課題?？鄥⑺啬z囊的主要成分是氧化苦參堿，具有廣泛的生物活性?，F(xiàn)代藥理研究[1]表明氧化苦參堿在穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、促進受損肝細(xì)胞的修復(fù)方面有一定的作用，同時還具有改善肝臟微循環(huán)、促使膽紅素排泄、抑制肝臟細(xì)胞纖維化因子釋放等作用。苦參素膠囊主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎，在治療酒精性肝損傷方面研究報道較少，因此本課題就苦參素膠囊對急性酒精性肝損傷的保護作用進行研究，初步探討其可能的機制，進一步挖掘苦參素膠囊的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR 雄性小鼠72 只，體質(zhì)量25 ～ 30 g，由浙江省動物醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物合格證號：SCXK（浙）20080033。

1.2 藥物及其配制

受試藥：苦參素膠囊（江蘇正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，規(guī)格：0.1 g，批號：140927302），用蒸餾水配制成濃度為0.03 g·mL-1的藥液，4 ℃冷藏保存。

陽性藥：聯(lián)苯雙酯滴丸（浙江萬邦藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1.5 mg，批號：A02141125），用蒸餾水配制成濃度為0.375 mg·mL-1的藥液，4 ℃冷藏保存。

造模劑：55 度北京紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司，規(guī)格：500 mL，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：GB/T20822），4 ℃冷藏保存。

1.3 試劑與儀器

試劑：考馬斯亮藍(lán)、丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，規(guī)格：100T/96 樣；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒均購自杭州唐榮科技有限公司。

儀器：東芝ACCUTETBA-40FR 全自動生化分析儀（東芝三廠醫(yī)療株式會社）；XHF-b 高速分散器 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；LQA10002 電子天平（杭州友恒稱重設(shè)備有限公司）；Power Wave340酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK公司）；Thermo離心機。

1.4 動物分組及處理

健康ICR雄性小鼠72只，隨機分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組（陽性組）、苦參素低劑量組、苦參素中劑量組、苦參素高劑量組，共6組，每組12只。正常組給予蒸餾水，體積為0.1 mL·10 g-1體重。除正常組外，其余各組動物均參照成人10 倍量灌胃給予55度二鍋頭，每日灌胃兩次，間隔12 h；造模同時，灌胃給予各受試藥，連續(xù)7 d。

1.5 樣品采集與指標(biāo)檢測

末次給藥后禁食不禁水，12 h后稱體重，摘眼球取血，靜置，離心（3500 r·min-1，10 min）得血清，全自動生化分析儀測定ALT、AST、TC、TG、ALP含量。迅速取出肝臟，稱量肝濕重，計算肝臟系數(shù)（肝臟系數(shù)=肝臟重量/體重×100%）。準(zhǔn)確稱取肝臟0.5 g，用生理鹽水制作成10%的肝勻漿液，靜置，離心（3500 r·min-1，10 min）取上清液，采用相關(guān)試劑盒檢測SOD活性及MDA的含量，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方法

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)觀察

實驗過程中，正常組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，食欲佳，動作自如，反應(yīng)靈敏，無嗜睡現(xiàn)象，排便正常。模型組小鼠均有不同程度的精神萎靡，毛發(fā)無光澤，嗜睡，食欲減退，反應(yīng)遲緩，體重增長緩慢，出現(xiàn)稀便現(xiàn)象?？鄥⑺馗鲃┝拷M小鼠精神狀態(tài)與飲食、體重等情況均較模型組有所改善。

2.2 對急性酒精性肝損傷小鼠體重的影響

表1 顯示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠體重從第4天開始逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，苦參素各劑量組小鼠體重均有所改善。

2.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響

表2 顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟系數(shù)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01），表明酒精能導(dǎo)致小鼠肝臟腫大。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低小鼠的肝臟系數(shù)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。表明苦參素膠囊可以緩解急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟腫大。

2.4 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性的影響

表3 顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT，AST顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低血清中ALT、AST活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。表明苦參素膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠ALT、AST活性具有一定的改善作用。

表1 對急性酒精性肝損傷小鼠體重的影響. g, x ± s , n = 12Tab 1 Effect of body weight of marine capsule on acute alcoholic liver injury. g, n = 12

表1 對急性酒精性肝損傷小鼠體重的影響. g, x ± s , n = 12Tab 1 Effect of body weight of marine capsule on acute alcoholic liver injury. g, n = 12

注：與正常組相比，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with normal group, △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01； compared with model group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天正常組 26.03±1.98 25.84±1.84 25.73±1.83 26.06±1.86 26.43±2.20 27.43±1.93 27.32±1.89 28.46±2.03模型組 27.21±2.27 25.38±2.20 24.43±3.00 21.73±2.75△ 19.54±6.11△△ 20.75±3.00△△21.30±2.82△△21.47±2.73△△陽性組 26.60±1.61 25.61±2.21 24.01±2.44 22.20±2.89* 22.77±3.56* 22.52±3.46* 22.09±3.35** 22.56±3.59*苦參素低劑量組 26.69±1.63 25.31±1.70 24.46±2.07 23.62±2.82 23.55±2.92 22.59±2.16 22.19±2.35 22.57±1.66苦參素中劑量組 26.57±1.63 24.63±1.88 23.28±2.38 23.87±2.52 24.82±2.45 24.17±2.84 23.93±1.95 23.94±1.94苦參素高劑量組 26.96±1.60 24.99±1.97 24.08±2.56 23.60±3.02 23.14±3.31 22.99±3.33 22.44±3.53 22.65±3.79

表2 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響. , n = 12 Tab 2 Effect of liver index of marine capsule on acute lcoholic liver injury. n = 12

表2 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響. , n = 12 Tab 2 Effect of liver index of marine capsule on acute lcoholic liver injury. n = 12

注：與正常組相比，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with normal group, △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01； compared with model group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

組別 劑量/g·kg-1 體質(zhì)量/g 肝重/g 肝臟系數(shù)/%正常組 - 26.85±1.05 1.15±0.14 4.276±0.570模型組 - 19.94±2.45 0.99±0.27 4.916±0.866△△陽性組 3.75×10-3 21.28±2.71 0.93±0.16 4.333±0.482*苦參素低劑量組3.75×10-2 20.54±1.33 0.90±0.11 4.384±0.301*苦參素中劑量組0.075 22.43±2.22 1.05±0.17 4.671±0.464*苦參素高劑量組0.150 20.99±3.69 0.91±0.22 4.298±0.533*

表3 對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT與AST活性的影響. n = 12Tab 3 Effect of ALT, AST levels in serum of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

2.5 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中TC、TG水平的影響

表4 顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中TC、TG 顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低血清中TG 水平，中劑量組和高劑量組能降低TC 水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）；苦參素低劑量組具有降低TC水平的趨勢。表明苦參素膠囊可以降低急性酒精性肝損傷小鼠血清中TC、TG水平。

2.6 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALP、LDH活性的影響

表5 顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中ALP、LDH 活性顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能降低血清中ALP、LDH水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。表明苦參素膠囊可以降低急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALP、LDH活性。

表4 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中TC、TG水平的影響. n = 12Tab 4 Effect of TC, TG levels in serum of marine capsule on acute alcoholic liver injury. n = 12

表5 對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALP與LDH活性的影響. n = 12Tab 5 Effect of ALP, LDH levels in serum of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

2.7 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中SOD、MDA含量的影響

表6 顯示，模型組小鼠肝組織MDA 含量較正常組顯著升高，SOD活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。與模型組比較，苦參素各劑量組均能顯著降低小鼠肝組織中MDA 含量，中、高劑量組明顯提高SOD 活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。表明苦參素膠囊對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD水平具有不同程度的改善作用。

3 討論

ALD 是由于過量攝入酒精而引起肝臟損害的一系列急、慢性病理性改變導(dǎo)致的疾病。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進而發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及肝硬化，嚴(yán)重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝衰竭[2]。致病因素是長期大量酒精的攝入，但其發(fā)病機制尚不完全清楚。文獻[3-4]研究表明，氧化應(yīng)激和氧化應(yīng)激誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化是導(dǎo)致ALD 病理損傷的重要機制之一，氧化應(yīng)激是指當(dāng)機體受到有害刺激時，活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等一些體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生過多，超出抗氧化物的清除能力，打破氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡，從而導(dǎo)致肝臟的損傷。

表6 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織中SOD與MDA水平的影響. n = 12Tab 6 Effect of SOD, MDA levels in liver tissue of marine capsules on acute alcoholic liver injury. n = 12

臨床上活性酶ALT 和AST 是反映肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)，正常情況下，血清中兩種酶只存在于細(xì)胞內(nèi)，血清中很少，活性非常低，當(dāng)肝細(xì)胞病變受損時，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜通透性增加，肝細(xì)胞內(nèi)ALT 和AST 大量釋放入血，導(dǎo)致血清中的ALT 和AST 水平升高[5]。MDA 為機體脂質(zhì)過氧化的重要終產(chǎn)物，它的增加或減少可反映脂質(zhì)過氧化程度的增加或減少，因此可以通過檢測MDA的含量衡量肝組織過氧化損傷和治療后肝細(xì)胞的恢復(fù)情況[6]。在正常生理狀態(tài)下，肝臟中的抗氧化劑SOD能及時清除氧自由基，使機體免受氧化損傷，當(dāng)自由基產(chǎn)生過多，超過抗氧化劑的清除能力，使體內(nèi)氧自由基蓄積，損傷肝細(xì)胞，因此SOD 活力的高低可以反映機體清除氧自由基的能力[7]。

苦參素膠囊的主要成分是氧化苦參堿，可以清除氧自由基，抑制氧自由基的釋放和磷脂酶的活化，穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，促進受損肝細(xì)胞的修復(fù)，改善肝臟微循環(huán)，抑制肝細(xì)胞纖維化因子的釋放，從而恢復(fù)肝細(xì)胞功能，保護肝臟[1]。魏紅等[8]在研究苦參堿微乳與苦參素膠囊對小鼠急性肝損傷保護作用的對比中發(fā)現(xiàn)苦參素膠囊可以使血清中ALT 和AST 水平低于模型組，表明苦參素膠囊對小鼠肝臟具有保護作用。有研究[9]表明，苦參素可以阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝臟的纖維化，從而阻止肝臟的惡性發(fā)展。

實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT、AST、ALP、LDH 活性顯著升高，TG、TC 水平顯著增加（P ＜ 0.01），肝組織SOD活性明顯降低（P ＜ 0.05），肝組織MDA 明顯升高（P ＜ 0.05）。以上數(shù)據(jù)表明，急性酒精性肝損傷造模成功。模型組小鼠血清ALT、AST活性明顯升高，表明肝細(xì)胞膜通透性增大，ALP、LDH、TG、TC水平顯著升高，表明肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。而給予苦參素膠囊治療后，小鼠肝臟系數(shù)，血清中ALT、AST、ALP、LDH活性及TG、TC含量顯著降低，說明苦參素膠囊能保護肝細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，對酒精性肝損傷有一定的保護作用?？鄥⑺啬z囊能顯著抑制酒精性肝損傷小鼠肝組織中MDA含量的升高，SOD活性顯著增強，說明苦參素膠囊通過阻斷脂質(zhì)過氧化，增強小鼠肝臟抗氧化而產(chǎn)生保護肝臟的作用。

綜上所述，苦參素膠囊對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能與清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)，通過增強體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡，提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而達到保護肝細(xì)胞的目的。本研究結(jié)果表明，苦參素膠囊對酒精誘導(dǎo)的急性酒精肝損傷小鼠模型表現(xiàn)出較好的抗損傷作用，提示苦參素膠囊具有廣闊的開發(fā)前景，值得進一步深入開發(fā)。