薛永霞，張作乾，張洪才，張 菊，衛(wèi)賽超，陳舜勝,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心（上海），上海 201306）

我國淡水資源豐富，2016年草魚產(chǎn)量為590萬 t，居于淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量首位，占20.96%[1]。目前，草魚主要以生鮮銷售為主，其貯藏期較短，生產(chǎn)受到地域和季節(jié)的限制，若集中上市，易造成產(chǎn)品積壓和腐敗變質(zhì)，從而導(dǎo)致資源浪費，制約淡水漁業(yè)的發(fā)展[2]。此外，草魚固有的腥味令消費者難以接受，去除淡水魚固有的腥味近年來受到高度關(guān)注。通過上海熏魚的加工方式不僅可以保持草魚本身的營養(yǎng)與風味物質(zhì)，還能改善其固有的腥味，以豐富市場產(chǎn)品供應(yīng)和滿足消費者需求。目前，國內(nèi)對于草魚風味成分的研究主要集中在生鮮魚肉及其制品，極少研究熟制魚肉及其制品的風味成分。陳桂平[3]研究了草魚低溫貯藏期間風味成分的變化，李金林等[4]研究了傳統(tǒng)魚湯烹煮過程中揮發(fā)性成分的變化，但并未對不同加工階段熟制魚肉風味物質(zhì)的變化進行研究報道。上海熏魚是一道滬系特色傳統(tǒng)名菜，一般以草魚為加工原料，深受江南地區(qū)居民喜愛。上海熏魚風味形成于不同加工階段，但其不同加工階段對上海熏魚風味成分的影響尚不明確。

本實驗采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氨基酸自動分析法和固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry， SPME-GC-MS）法對不同加工階段上海熏魚的核苷酸、游離氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)進行鑒定與分析，確定不同加工階段上海熏魚風味成分及其關(guān)鍵風味物質(zhì)，以豐富淡水魚風味化學的理論知識和為淡水魚的深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚，約2.5 kg/尾，購自上海市浦東新區(qū)古棕路農(nóng)工商超市，經(jīng)充氧運回。急殺后，去除魚鱗、魚鰭、內(nèi)臟等，洗凈后切段（1.5 cm左右）。

腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）標準品、二磷酸腺苷酸（adenosine diphosphate，ADP）標準品、肌苷酸（inosine monphosphate，IMP）標準品、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）標準品 美國Sigma公司；一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）標準品、次黃嘌呤核苷（insoine，HxR）標準品 日本TCI公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甲醇（均為色譜純），高氯酸（perchloric acid，PCA）、氫氧化鉀、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氫氧化鈉、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；17 種氨基酸混標為色譜純 中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

W2690/5 HPLC儀 美國Waters公司；L-8800氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司；涂層厚度65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）固相微萃取頭 美國Supelco公司；6890-5975 GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；AUW320電子分析天平 日本島津公司；H2050R高速冷凍離心機 長沙湘儀有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；HY-81電熱炸鍋 佛山市南海泊菲機電設(shè)備有限公司；ZQ02CJ2不黏鍋 浙江愛仕達電器股份有限公司；JYC-21HEC05電磁爐 九陽股份有限公司；DW-25W300低溫冰箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加工工藝

傳統(tǒng)上海熏魚加工分為3 個階段：第1次浸漬（30 min）→油爆（180 ℃，5 min）→第2次浸漬（1 min）。其中，第1次浸漬：料酒（20%）、食用鹽（1.5%）、蔥（2%）、姜（1%）、蒜（1%）、胡椒粉（1%）和生抽醬油（5%）浸漬30 min。油爆：油爆溫度180 ℃，油爆時間5 min。第2次浸漬：葵花籽油（5%）、五香粉（0.1%）、白砂糖（3%）、生抽醬油（10%）、水（60%）熬制10 min后浸漬1 min。

本實驗研究上海熏魚加工過程中的5 個階段：生鮮草魚（A0）、一次浸漬（A8）、生鮮油爆（B0，生鮮草魚直接油爆）、一次浸漬后油爆（B8）、一次浸漬后油爆，再二次浸漬（C3，上海熏魚）。浸漬和油爆后魚肉均瀝干料液與油。

1.3.2 核苷酸類化合物測定

參考Yokoyama等[5]的方法測定。分別稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入質(zhì)量分數(shù)為10%的PCA溶液10 mL，勻漿后冷凍離心（10 000 r/min、15 min、4 ℃），取上清液，用5 mL 5%的PCA溶液洗滌沉淀，再次離心，重復(fù)以上操作2 次，合并上清液，用10 mol/L和1 mol/L的KOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.50，靜置30 min，取上清液定容到50 mL，搖勻，過0.22 μm膜后待測。整個處理過程均在0～4 ℃條件下操作。

HPLC條件：ODS-SPC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），保護柱柱芯（4 mm×10 mm，5 μm）；流動相A為0.05 mol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀（1∶1，V/V）溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.50，流動相B為甲醇溶液，等梯度洗脫；流速1 mL/min；柱溫28 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

1.3.3 游離氨基酸測定

參考陳劍嵐等[6]的分析方法。分別稱取2.00 g樣品，加入15 mL質(zhì)量分數(shù)為15%的TCA溶液，勻漿后靜置2 h，冷凍離心（10 000 r/min、15 min、4 ℃），取上清液5 mL，用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至2.00，定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm膜后待測。

氨基酸自動分析儀條件：色譜柱（4.6 mm×60 mm）；分離樹脂：陽離子交換樹脂；柱溫度：57 ℃；檢測波長：570 nm（脯氨酸440 nm）；1通道緩沖溶液流速：0.40 mL/min；反應(yīng)液：茚三酮試劑；2通道反應(yīng)液流速：0.35 mL/min；進樣量：20 μL。

1.3.4 GC-MS分析

準確稱取攪碎后的魚肉2.5 0 g，然后加入2.50 mL 0.18 g/mL NaCl溶液，勻漿后迅速置于20 mL頂空瓶中加蓋待測。頂空固相微萃取條件：采用65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭，萃取溫度45 ℃，萃取時間40 min。

色譜條件：程序升溫[7]：柱初溫40 ℃，保持2 min，之后以4 ℃/min升至160 ℃，然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；不分流模式進樣；載氣（He）流量：1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；解吸溫度250 ℃；解吸時間5 min。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z35～350。

數(shù)據(jù)分析：揮發(fā)性成分通過NIST 02和Wiley質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行匹配定性，且當正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的化合物才予以報道[8-9]。采用面積歸一化法計算各樣品中揮發(fā)性成分的相對含量，以定量樣品中揮發(fā)性成分，然后對數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行方差和顯著性分析[10]。

1.3.5 關(guān)鍵風味化合物的確定[11]

采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法，對樣品總體風味貢獻最大的組分ROAVstan為100，對其他揮發(fā)性成分按以下公式計算：

式中：Cri和Ti分別為各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量和相應(yīng)的感覺閾值；Crstan和Tstan分別為樣品總體風味貢獻最大組分的相對含量和相應(yīng)的感覺閾值。

所有組分：0≤ROAV≤100，ROAV值越大表明該組分對樣品總體風味貢獻程度越大；ROAV≥1，對樣品總體風味貢獻顯著，為該樣品的關(guān)鍵風味化合物。

1.4 數(shù)據(jù)處理

核苷酸類化合物和游離氨基酸數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，同時采用Duncan法進行顯著性分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工階段上海熏魚的核苷酸含量分析

表1 不同加工階段上海熏魚的核苷酸含量Table 1 Nucleotide contents of Shanghai smoked fi sh at different processing stages

由表1可知，不同加工階段對草魚肉核苷酸類的含量有較明顯影響。AMP在生鮮草魚、一次浸漬、生鮮油爆、一次浸漬后油爆和上海熏魚中的含量分別為13.54、5.96、14.91、15.69、11.21 mg/100 g，一次浸漬樣品中含量最低，其他樣品間差異顯著（P＜0.05）。雖然各樣品中AMP的含量較低，但研究表明，AMP與IMP、谷氨酸和天冬氨酸有協(xié)同增鮮的作用[14-15]。Hx呈苦味，上海熏魚中其含量比生鮮魚肉降低了68.34%，表明上海熏魚加工方式可改善草魚的苦味。IMP在生鮮草魚、一次浸漬、生鮮油爆、一次浸漬后油爆和上海熏魚中的含量分別為215.91、270.20、384.93、370.11、284.56 mg/100 g，生鮮油爆＞一次浸漬后油爆＞上海熏魚＞一次浸漬＞生鮮魚肉，生鮮魚肉IMP的TAV為8.64，其他樣品的TAV均有所增加，表明各樣品的IMP對呈味都有重要貢獻。其原因主要是魚類死后，ATP的降解順序依次為ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx[16]；核苷酸在中性條件下穩(wěn)定性較好，酸性或堿性條件穩(wěn)定性較差[17]，料酒可改變魚肉的pH值[18]，促進ATP降解；呈味核苷酸作為增鮮劑添加到醬油中[19]；樣品含水量越高核苷酸耐熱性越差[17]，邱霞琴等[20]有相似的研究，發(fā)現(xiàn)加熱草魚肉15 min后僅ATP含量顯著下降，IMP含量顯著增加，表明高溫可以促進ATP降解，IMP快速積累。研究表明IMP具有強烈的鮮味[21]，故IMP是不同階段主要的鮮味核苷酸。

2.2 不同加工階段上海熏魚的游離氨基酸分析

由表2可知，生鮮草魚、一次浸漬、生鮮油爆、一次浸漬后油爆和上海熏魚中游離氨基酸分別為396.94、421.02、517.03、560.11、585.79 mg/100 g，呈味氨基酸比依次為28.33%、38.66%、32.69%、44.90%、50.09%，呈顯著性上升趨勢；上海熏魚（二次浸漬）中味道愉悅的呈味氨基酸比生鮮草魚、一次浸漬、生鮮油爆和一次浸漬后油爆樣品分別提高了36.46%、15.39%、58.49%、76.81%。如表3所示，各加工各階段呈味氨基酸（除脯氨酸）的TAV與生鮮魚肉相比均呈顯著性上升趨勢，天冬氨酸和谷氨酸在一次浸漬后油爆和上海熏魚的TAV大于1，且在上海熏魚中分別達到最大值2.73和21.46，其他階段雖TAV小于1，但均顯著性高于生鮮魚肉，表明浸漬和油爆后魚肉的鮮味得以顯著性提高。其原因是首先料酒中的乙醇破壞草魚魚肉中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，然后調(diào)味料如料酒、鹽、蔥、姜汁等在乙醇的引導(dǎo)下也順利地進入到原料內(nèi)部，加速蛋白質(zhì)水解，從而促進氨基酸溶出[18]。生抽醬油中的游離氨基酸進入到魚肉內(nèi)部，魚體自身的組織蛋白在分解作用以及高溫環(huán)境下氧化降解[22]。組氨酸呈苦味[23]，上海熏魚中其含量比生鮮魚肉降低了27.94%，主要原因是魚肉中存在醛類化合物，而組氨基酸可與還原性化合物進行強烈的美拉德反應(yīng)[24]。浸漬和油爆有助于提高游離氨基酸總量和呈味氨基酸含量，從而顯著性提高魚肉鮮味，浸漬對魚肉風味貢獻更為顯著，浸漬和油爆對魚肉風味有協(xié)同作用。

表2 不同加工階段上海熏魚游離氨基酸的含量Table 2 Contents of free amino acids of Shanghai smoked fi sh at different processing stages mg/100 g

表3 不同加工階段上海熏魚呈味氨基酸TAVTable 3 Taste activity value of fl avor amino acids of Shanghai smoked fi sh meat at different processing stages

2.3 不同加工階段上海熏魚的揮發(fā)性物質(zhì)分析

表4 不同加工階段上海熏魚揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量Table 4 Relative contents of volatile components of Shanghai smoked fi sh at different processing stages

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表5

生鮮草魚、一次浸漬、生鮮油爆、一次浸漬后油爆和上海熏魚中揮發(fā)性物質(zhì)分別為36、75、34、73、78種（表4），主要由醛類、酮類、醇類和烴類構(gòu)成，以及少量的醚類、含氮類、酸類、酯類、芳香族類和其他化合物。3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、己醛、庚醛、苯乙醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、癸醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、右旋檸檬烯、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-正戊基呋喃是上海熏魚的主要關(guān)鍵風味化合物（表5）。魚肉的揮發(fā)性風味成分主要由醛類、醇類、烴類、吡嗪類和呋喃類物質(zhì)組成，對草魚肉風味形成具有重要貢獻。

表5 不同加工階段上海熏魚肉揮發(fā)性物質(zhì)的ROAVTable 5 Relative odor activity values of volatile components of Shanghai smoked fi sh at different processing stages

2.3.1 醛類和酮類

生鮮草魚、一次浸漬、生鮮油爆、一次浸漬后油爆和上海熏魚中醛類分別為8、14、9、11、12 種，相對含量分別為37.32%、5.85%、45.18%、29.39%、24.56%；酮類分別為2、2、3、4、4 種，相對含量分別為6.67%、0.36%、23.05%、2.48%、2.47%（表4）；顯然，生鮮魚肉中醛酮類含量顯著高于一次浸漬，主要是因為魚肉自身或一次浸漬液中醛類、氨基酸和糖被還原，以及脂肪酸酶促氧化為醇類[25]；生鮮油爆中醛酮類含量最高，后兩個階段均顯著下降，主要是因為羰基化合物（醛、酮）是由魚肉的脂肪酸氧化生成，高溫可加速脂肪酸氧化降解[26-27]，魚肉或浸漬液中氨基酸和糖被還原。

己醛、庚醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛是魚類典型的腥味物質(zhì)[8,28-30]，己醛、庚醛和壬醛分別在濃度適宜時呈青草、果子和草香氣味，濃度較高時呈酸敗味、魚腥味或脂肪味，閾值分別為4.5、2.8、1 μg/kg[8,28-29]，各階段均顯著低于生鮮魚肉，表明浸漬和油爆可有效改善腥味等不愉快的風味，各樣品ROAV大于1，表明對魚肉風味具有重要貢獻。(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛分別呈脂肪味[8]和雞油味[30]，前者各階段含量均顯著性低于生鮮魚肉，后者在生鮮油爆和一次浸漬后油爆中含量顯著性高于生鮮魚肉，其他階段均顯著低于生鮮魚肉，兩者對風味具有重要貢獻（表5），主要原因是香辛料的掩蔽作用掩蓋了那些不受歡迎的異味，或香辛料的有機成分與腥味成分發(fā)生了某些化學反應(yīng)[31]。?zyurt等[32]發(fā)現(xiàn)(E,E)-2,4-癸二烯醛在油炸樣品中大量檢出，主要來源于亞油酸甲酯氫過氧化物的自動氧化[3]，表明油爆促進了脂肪酸的氧化，這與本實驗結(jié)果一致。癸醛呈甜香和柑橘香氣[33]，各樣品均被檢出，苯乙醛呈濃郁的玉簪花香氣，生鮮魚肉中未檢出，其他階段均被檢出，兩者對上海熏魚風味有重要貢獻。苯甲醛呈堅果香、杏仁香和果香味[34]，在油爆后被檢出，對風味形成有一定的修飾作用，加熱是其產(chǎn)生的重要條件[34]。3-甲基丁醛和2-甲基丁醛呈果香味，在一次浸漬后油爆和上海熏魚中檢出，對魚肉的風味形成有一定貢獻。研究表明，二酮類是美拉德反應(yīng)的初級階段產(chǎn)物[28]，具有肉香味，2,3-辛二酮在油爆后樣品中檢出，故推測油爆過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)。各樣品中醛類的種類較多，相對含量較高，對魚肉整體風味形成具有重要貢獻，酮類則相反，油爆是脂肪氧化降解的重要條件，加工后的草魚肉，腥味得以改善，特征風味得以豐富。

2.3.2 醇類和烴類

生鮮草魚、一次浸漬、生鮮油爆、一次浸漬后油爆草魚和上海熏魚樣品中醇類分別為7、19、4、9、12 種，相對含量為39.56%、56.63%、7.39%、10.39%、6.83%；烴類分別為11、24、9、24、19 種，相對含量為9.38%、23.94%、14.98%、30.29%、12.99%（表4）。一次浸漬中醇類的種類和相對含量均最高，生鮮魚肉醇類含量次之，其他階段醇類的含量均顯著性降低，但上海熏魚醇類的種類較為豐富；主要原因：1）醇類主要來源于醛類物質(zhì)、氨基酸和糖的還原以及脂肪酸酶促氧化等[25]，如一次浸漬中己醇相對含量約24.89%；2）后3 個階段油爆促進醇類氧化為醛酮類物質(zhì)；3）生鮮魚肉中1-辛烯-3-醇相對含量約22.92%，呈蘑菇香和泥土的氣味，導(dǎo)致魚肉具有較重的泥土味[35]，各加工階段含量均顯著低于生鮮魚肉，上海熏魚中含量最低，表明泥土味得以改善。一次浸漬、生鮮油爆、一次浸漬后油爆和上海熏魚中烴類的含量顯著性高于生鮮魚肉，尤其是萜類含量顯著提高，表明調(diào)味輔料和油爆是烴類的重要來源，主要原因是：1）蒎烯、莰烯、β-甜沒藥烯、姜烯和冰片是生姜精油的主要成分[36-37]，3-蒈烯、古巴烯和石竹烯是胡椒的主要成分[38]，這與本實驗檢出結(jié)果一致；2）烷烴主要來自脂肪酸烷氧自由基的均裂[10]，油爆促進了脂肪酸的烷氧化。蒎烯呈清香、樟腦香和松木香，莰烯、姜烯和冰片呈松木香和樟腦香，β-甜沒藥烯呈木香，β-蒎烯呈樹脂和松脂香氣[39]，3-蒈烯呈辛辣味，古巴烯呈辛辣味，石竹烯呈木香、柑橘香與丁香香氣[38]，均對魚肉風味具有一定貢獻。右旋檸檬烯呈鮮花香氣，可進一步氧化生成醛酮醇類化合物，是風味化合物潛在的前體物質(zhì)[39]，各加工階段均顯著性高于生鮮魚肉，對魚肉風味有一定貢獻。飽和醇類的閾值很高，對魚肉風味貢獻很小，而不飽和醇類的閾值相對較低，對樣品總體風味形成具有一定貢獻[40]。研究表明調(diào)味輔料和油爆是烴類形成的重要來源，對風味形成有一定貢獻。

2.3.3 含硫、含氮類和醚類

含硫化合物僅在一次浸漬、一次浸漬后油爆和上海熏魚中檢出，一次浸漬種類最多，含量最高，表明其主要來自調(diào)味輔料。研究表明，硫化丙烯、甲基烯丙基硫醚和二烯丙基硫醚等含硫化合物是大蒜和洋蔥等原材料重要的香味物質(zhì)，呈大蒜味、洋蔥味和辣根味，是烹調(diào)時去腥、脫臭和調(diào)味的重要調(diào)味品[41]，這與本實驗研究結(jié)果一致。一次浸漬后樣品均檢出二甲醚，呈輕微醚香氣味，4-烯丙基苯甲醚呈大茴香似香氣，是五香粉的主要成分之一[42]。各樣品中含氮化合物主要是吡嗪和吡咯，僅在油爆后樣品檢出，上海熏魚中含氮物質(zhì)種類最多，高達8種，表明美拉德反應(yīng)需要在一定加熱條件下發(fā)生，二次浸漬中添加生抽醬油和白砂糖也參與了美拉德反應(yīng)。研究表明，吡嗪類化合物是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，常在加熱過程中產(chǎn)生，呈濃烈的堅果和烘烤香氣[28]。本實驗檢出的2-乙酰基吡咯呈烤香和焦甜香[28]，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪對上海熏魚的風味貢獻顯著，豐富了魚肉的風味成分。

2.3.4 芳香族和其他

各樣品中芳香族會使魚肉呈不愉快的風味[28,43]，其加工后含量均顯著下降，表明魚體令人不悅的風味得以改善。研究發(fā)現(xiàn)本實驗檢出的甲苯、對二甲苯、甲氧基-苯基肟、1,2,3,4-四甲苯、萘和2-甲基萘是從受污染的環(huán)境中富集到魚體內(nèi)，表明魚類的生長環(huán)境會影響到其風味[28,43-44]。一次浸漬后檢出的茴香腦和丁香酚，前者呈甜味和茴香香氣，是胡椒粉和五香粉的主要成分之一[38,42]，后者呈強烈的丁香香氣，是胡椒粉的主要成分之一[42]，對上海熏魚風味貢獻顯著。酸類和酯類的種類相對很少，閾值較高，含量也較低，故對風味形成貢獻較小。在一次浸漬、一次浸漬后油爆和上海熏魚中均檢出2-甲基丁酸甲酯，呈蘋果和郎姆酒香味[18]，閾值僅為0.25 μg/kg，對魚肉風味貢獻顯著。2-正戊基呋喃閾值僅為5.8 μg/kg，呈果蔬香味[45]，加工階段呈顯著上升趨勢，可作為肉品脂質(zhì)氧化的指示物[45]，對魚肉風味貢獻顯著。

3 結(jié) 論

不同加工階段草魚的呈味核苷酸、游離氨基酸、呈味氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)含量均顯著性增加，魚體腥味得以明顯改善。浸漬是改善腥味和豐富風味的重要條件，不同輔料對風味均有重要貢獻。油爆加速了脂肪氧化降解，加熱是美拉德反應(yīng)的必要條件，通過研究上海熏魚在不同加工階段的風味變化，可豐富淡水魚風味化學的理論知識和為淡水魚的深加工提供理論支持。