李曉雷，鄭麗麗，艾斌凌，鄭曉燕，楊 旸，楊勁松*，盛占武,*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，海南 海口 570102；2.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；3.海口市香蕉生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570102）

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，其化學(xué)名為3,5,7,3’,4’-五羥黃酮，以糖苷的形式廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)中[1]。槲皮素具有抑制腫瘤細(xì)胞、抗氧化、降血壓、降血脂、止咳平喘等生理功能和藥理作用[2]。也有實(shí)驗(yàn)表明槲皮素對(duì)以D-葡萄糖、DL-甘油醛[3]、甲基乙二醛、乙二醛[4]為底物的蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)體系中晚期糖基化終末產(chǎn)物的生成具有明顯抑制作用。也有體外實(shí)驗(yàn)表明槲皮素對(duì)二羰基化合物造成的DNA損傷有抑制作用[4]。但是由于槲皮素不溶于水，實(shí)驗(yàn)階段一般用二甲亞砜和乙醇作為溶劑，在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，這兩種溶劑均具有細(xì)胞毒性[5-6]。實(shí)際應(yīng)用中，水溶性差問題限制了槲皮素的應(yīng)用范圍，在生產(chǎn)槲皮素類藥物時(shí)一般通過導(dǎo)入親水性基團(tuán)來增加其水溶性[7]，如槲皮素氧乙酸賴氨酸鹽。目前用于包埋槲皮素提高其水溶解性的主要材料是β-環(huán)糊精和丙基-β-環(huán)糊精[8]，鮮見有用蛋白作為載體用于結(jié)合槲皮素以期提高其水溶性的報(bào)道。

β-乳球蛋白是牛奶中含量最豐富的乳清蛋白，是一種水溶性蛋白質(zhì)，由于其營(yíng)養(yǎng)和功能特性，常被用作食品添加劑[9]。β-乳球蛋白分子是一種高度結(jié)構(gòu)化的球狀蛋白質(zhì)，含有9 條β-折疊和1 段較長(zhǎng)的α-螺旋、4 段較短的α-螺旋，其中8 條反平行的β-折疊組成內(nèi)包含花萼狀疏水孔穴的β-桶型結(jié)構(gòu)，有A、B、C三種不同的構(gòu)象[10]。研究表明，β-乳球蛋白單體上含有多個(gè)可結(jié)合疏水性配體的空穴[11]，因此常被用來作為一些疏水小分子的配體。已有研究表征了球狀蛋白與多酚之間的非共價(jià)相互作用[12]，該相互可用可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)解折疊和沉淀[13]，并且影響蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[14]。也有研究發(fā)現(xiàn)膳食多酚和乳蛋白相互作用降低了蛋白質(zhì)對(duì)胃蛋白酶消化的敏感性[15]。Jia Jingjing等[16]的研究表明綠原酸、阿魏酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯與β-乳球蛋白結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致蛋白表面疏水性改變。但是關(guān)于β-乳球蛋白與多酚之間相互作用的潛在機(jī)制尚未完全闡明，且目前多見將β-乳球蛋白A用于載體的報(bào)道，鮮見有β-乳球蛋白B與多酚相互作用機(jī)制的報(bào)道。

許多疏水性多酚和黃酮類化合物雖然具有生理活性和藥理作用，但是在應(yīng)用過程中卻存在水溶性差的問題。目前，已有研究表明在與水溶性蛋白質(zhì)結(jié)合后它們的溶解度得到了顯著提高。T?nnesen等[17]研究了姜黃素-大豆分離蛋白絡(luò)合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合大豆分離蛋白后其水溶性得到顯著的提高。Esmaili等[18]利用酪蛋白包埋姜黃素使其溶解度提高2 500 倍左右。此外，有研究表明酪蛋白和姜黃素結(jié)合后，二者的抗氧化活性均得到提高；β-乳球蛋白可以保護(hù)β-胡蘿卜素和VA，降低它們熱、光照和氧氣降解的速度[19]；Smoyamada等[20]研究了β-乳球蛋白和膳食多酚的相互作用，發(fā)現(xiàn)二者的親和力和體系的抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)。因此，水溶性蛋白質(zhì)與疏水性活性成分的結(jié)合不僅可以提高其溶解度，還可以保護(hù)活性成分的活性。

本研究以提高槲皮素的水溶性為切入點(diǎn)，用β-乳球蛋白B作為槲皮素載體，利用熒光光譜、等溫滴定量熱法和分子對(duì)接等多種手段，研究槲皮素與該蛋白的結(jié)合機(jī)制，結(jié)合后蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和槲皮素溶解度的變化，以期為槲皮素的應(yīng)用研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白B（純度≥90%）、乙腈（色譜純）美國Sigma公司；槲皮素（純度≥96.5%） 中國食品藥品檢定研究院；乙醇（分析純）、Na2HPO4、NaH2PO4西隴化工股份有限公司；甲醇、甲酸（均為色譜純）廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；Evolation 300型紫外-可見分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher Scientific公司；Chirascan型圓二色性（circular dichroism，CD）光譜儀 英國Applied Photophysics公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀、Multifuge X1R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司；Nano ITC型等溫滴定量熱儀、Upic I-Class型超高效液相色譜儀 美國Waters公司；ML 204型電子天平、S20K型pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；超聲波清洗機(jī) 深圳潔盟清洗設(shè)備公司；SHA-CA型恒溫水浴振蕩器 常州普天儀器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白溶液的配制及濃度確定

取適量β-乳球蛋白B置于離心管中，加入3 mL磷酸緩沖溶液（pH 7.4、50 mmol/L），輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使其充分溶解（盡量避免產(chǎn)生氣泡），靜置10 min后用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度。確定蛋白濃度：調(diào)節(jié)粗配好的溶液濃度，使其最大吸光度在1.76左右，然后另取一潔凈的離心管，先加入1 600 μL磷酸緩沖液（pH 7.4、50 mmol/L），再加入400 μL蛋白母液（即將蛋白稀釋5 倍），測(cè)吸光度，利用其摩爾吸光系數(shù)確定最終濃度[21]，蛋白溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 分子熒光的測(cè)定

在離心管中加入磷酸緩沖液（pH 7.4、50 mmol/L），再加入一定體積的蛋白溶液，最后加入一定量的槲皮素溶液獲得混合溶液，溶液充分混合后分別置于15、25、35 ℃的環(huán)境中1 h。最終獲得的混合溶液中蛋白濃度為1 μmol/L，槲皮素濃度分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μmol/L[22]。將每次配制好的樣品取2 mL進(jìn)行熒光掃描。熒光掃描條件：固定激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)305～460 nm，激發(fā)、發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速率12 000 nm/min[21]。

在25 ℃條件下，取濃度為1 μmol/L的蛋白溶液和濃度比1∶2（β-乳球蛋白B與槲皮素）的混合溶液分別測(cè)定三維熒光圖譜。測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)200～350 nm（采樣間隔2 nm），發(fā)射波長(zhǎng)200～500 nm（采樣間隔2 nm）[22]。

在25 ℃條件下，分別收集激發(fā)波長(zhǎng)在260～340 nm（Δλ=15 nm）和220～360 nm（Δλ=60 nm）的同步熒光光譜[22]。

1.3.3 分子熒光數(shù)據(jù)分析

熒光猝滅的機(jī)理用Stern-Volmer方程（1）分析[16]：

式中：F0和F分別為不含和含有槲皮素的蛋白溶液的熒光強(qiáng)度；[Q]為溶液中槲皮素濃度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；Kq為熒光猝滅速率常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光物質(zhì)的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命一般約為10－8s。

對(duì)于靜態(tài)猝滅，猝滅劑和蛋白之間的結(jié)合常數(shù)和每個(gè)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可用式（2）確定[23]：

焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和自由能（ΔG）變化根據(jù)Vant’s Hoff公式（3）和（4）確定[24]：

式中：R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol?K））；T為實(shí)驗(yàn)溫度；Ka為猝滅劑和蛋白的結(jié)合常數(shù)。

1.3.4 紫外-可見吸收光譜分析

取3 mL β-乳球蛋白B和槲皮素的混合溶液（蛋白濃度10 μmol/L，蛋白-槲皮素濃度比1∶1）在195～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定其吸光度，狹縫寬度為2.0 nm，取樣間隔為1 nm，用10 μmol/L的β-乳球蛋白B溶液作對(duì)照，用pH 7.4（50 mmol/L）的磷酸緩沖液作空白對(duì)照。

1.3.5 等溫滴定量熱儀分析

用ITC進(jìn)樣器吸取30 μmol/L的蛋白溶液300 μL（注意排凈氣泡）注入1.7 mL的樣品池中，用滴定注射器吸取600 μmol/L的槲皮素溶液50 μL，分20 次進(jìn)行滴定，每次滴定量2.0 μL、滴定溫度25 ℃、攪拌速率300 r/min、滴定時(shí)間間隔200 s，以獲得反應(yīng)熱相對(duì)于時(shí)間變化的原始數(shù)據(jù)。用600 μmol/L的槲皮素溶液滴定磷酸緩沖液（pH 7.4、50 mmol/L）作為對(duì)照。然后用原始數(shù)據(jù)減去對(duì)照實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)以獲得更正后的數(shù)據(jù)[21]。

1.3.6 CD光譜的測(cè)定

將蛋白母液和槲皮素溶液按照一定的比例混合，獲得蛋白濃度20 μmol/L且蛋白-槲皮素濃度比1∶1的混合溶液，取混合溶液在185～260 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定CD光譜，數(shù)據(jù)采集間隔為0.5 nm，掃描速率100 nm/min，響應(yīng)時(shí)間4 s。并在相同條件下測(cè)定濃度為20 μmol/L純蛋白溶液的CD光譜。對(duì)于獲得的數(shù)據(jù)，用CDpro軟件分析各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[25]。

1.3.7 FTIR分析

制備蛋白濃度為0.1 mmol/L且蛋白-槲皮素濃度比1∶1的混合溶液，在600～4 000 cm－1范圍內(nèi)測(cè)定其FTIR，信號(hào)采集模式為衰減全反射。在相同條件下測(cè)定濃度為0.1 mmol/L純蛋白溶液的FTIR。用磷酸緩沖液（pH 7.4，50 mmol/L）作空白對(duì)照。所得圖譜用Ominic軟件選取1 600～1 700 cm－1范圍內(nèi)的酰胺I帶分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用差譜消除技術(shù)消除水蒸氣在1 600～1 700 cm－1波段的干擾。最后用PeakFit軟件進(jìn)行分峰和曲線擬合，并計(jì)算各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[26]。

1.3.8 分子建模

用AutoDock軟件模擬槲皮素和β-乳球蛋白B的結(jié)合狀況。蛋白質(zhì)（PDB ID: 1BEB）的3D結(jié)構(gòu)從PDB網(wǎng)站獲取，槲皮素的3D結(jié)構(gòu)用ChemDraw軟件繪制。采用拉馬克遺傳算法計(jì)算蛋白質(zhì)和槲皮素結(jié)合的可能構(gòu)象。后續(xù)分析選擇對(duì)接結(jié)果中具有最低自由能的構(gòu)象[27]。

1.3.9 溶劑蒸發(fā)技術(shù)測(cè)定槲皮素溶解度的變化

準(zhǔn)確稱取10 mg β-乳球蛋白B和12 mg槲皮素，溶于4 mL 150 mL/L的乙醇中，備用。40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑。然后加入5 mL磷酸緩沖液（pH 7.4、50 mmol/L），旋蒸5 min獲得膠束溶液。將該溶液在37 ℃水浴中孵育過夜，然后10 000 r/min離心10 min[28]。取上清液，用甲醇稀釋100 倍備用。

制備質(zhì)量濃度梯度為30、15、7.5、3.75、1.9、0.95 μg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用高效液相色譜測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，最終確定樣品中槲皮素的溶解度。

色譜條件：色譜柱：Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸（45∶55，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。在上述條件下槲皮素的保留時(shí)間為0.45 min[29]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖處理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-乳球蛋白B和槲皮素的相互作用

蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸殘基可以發(fā)射熒光[30]。β-乳球蛋白B的19、61位為Trp殘基，20、42、99、102位為酪氨酸殘基[31]。因此，可以用β-乳球蛋白B中固有的Trp和酪氨酸殘基的熒光猝滅研究槲皮素和β-乳球蛋白B之間的相互作用。本研究選用295 nm作為固定激發(fā)波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下可認(rèn)為β-乳球蛋白B的內(nèi)源熒光全部來自于Trp殘基[17]。

圖1 β-乳球蛋白B溶液和不同濃度槲皮素溶液熒光曲線Fig. 1 Fluorescence spectra of β-lactoglobulin B solution and quercetin solutions of different concentrations

如圖1所示，β-乳球蛋白B產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度的發(fā)射波長(zhǎng)為338 nm，槲皮素的分子熒光強(qiáng)度隨著濃度的升高而增強(qiáng)，但是不同濃度的槲皮素在338 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度不隨濃度的變化而變化且為0，因此槲皮素對(duì)β-乳球蛋白B的熒光光譜的測(cè)定不會(huì)產(chǎn)生影響。

圖2 β-乳球蛋白B和不同濃度槲皮素混合溶液熒光曲線Fig. 2 Fluorescence spectra of β-lactoglobulin B mixed with different concentrations of quercetin

如圖2所示，沒有加入槲皮素時(shí)β-乳球蛋白B產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度的發(fā)射波長(zhǎng)為338 nm。加入槲皮素后，隨著槲皮素濃度升高，蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸降低，但熒光峰峰形保持不變且最大峰仍在338 nm波長(zhǎng)處，當(dāng)槲皮素濃度為18 μmol/L時(shí)蛋白的熒光強(qiáng)度約為原來的65.7%。這表明槲皮素與蛋白發(fā)生了結(jié)合，使得蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光發(fā)生了猝滅。

Jia Jingjing等[32]將β-乳球蛋白用于表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸和阿魏酸3 種多酚的載體，3 種多酚均使蛋白的熒光出現(xiàn)了不同程度的猝滅；Zhang Jie等[33]用β-乳球蛋白包埋葉酸、α-生育酚和白藜蘆醇的實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。Jia Jingjing[32]和Zhang Jie[33]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，在與多酚的結(jié)合過程中，β-乳球蛋白中能發(fā)射熒光的Trp殘基、酪氨酸殘基和苯丙氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅，并進(jìn)一步證實(shí)多酚的結(jié)合改變了β-乳球蛋白改變了蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，槲皮素的結(jié)合導(dǎo)致β-乳球蛋白B的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅的原因也可能是槲皮素改變了蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這在后面FTIR實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。

2.2 熒光猝滅機(jī)理

蛋白質(zhì)的熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[34]。對(duì)于靜態(tài)猝滅，靜態(tài)復(fù)合物的生成往往會(huì)導(dǎo)致熒光物質(zhì)吸收光譜的改變，且靜態(tài)復(fù)合物的猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而降低。動(dòng)態(tài)猝滅會(huì)影響到熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)，但并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜[35]。

基于上述原理，通過Stern-Volmer方程在3 個(gè)不同溫度（15、25、35 ℃）條件下分析β-乳球蛋白B的熒光猝滅數(shù)據(jù)，從圖3和表1可以發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白B的猝滅常數(shù)（KSV）隨著溫度的升高而降低，并且熒光猝滅速率常數(shù)（Kq）值高于最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)（2.0×1010L/（mol·s）），說明猝滅類型是典型的靜態(tài)猝滅。同時(shí)，從圖4可以看出，β-乳球蛋白B的吸收光譜在結(jié)合槲皮素后發(fā)生了明顯的紅移，說明β-乳球蛋白B的生色團(tuán)所處的微環(huán)境發(fā)生了變化，同時(shí)也印證了與槲皮素的結(jié)合使β-乳球蛋白B發(fā)生了靜態(tài)猝滅。

Bi Hongna等[36]用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究了靜態(tài)猝滅發(fā)生的機(jī)制，認(rèn)為在β-乳球蛋白與多酚結(jié)合的過程中，二者發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，即通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程，造成供體熒光強(qiáng)度降低，而受體可以發(fā)射更強(qiáng)于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時(shí)也伴隨著熒光壽命的相應(yīng)縮短或延長(zhǎng)。將這個(gè)原理用于解釋槲皮素使β-乳球蛋白B發(fā)生靜態(tài)猝滅的原因同樣行的通，在295 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下β-乳球蛋白B的激發(fā)態(tài)能量向槲皮素發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致自身的熒光強(qiáng)度降低。

圖3 不同溫度下槲皮素結(jié)合β-乳球蛋白B的Stern-Volmer曲線Fig. 3 Stern-Volmer curves of quercetin binding to β-lactoglobulin B at different temperatures

圖4 β-乳球蛋白B溶液和β-乳球蛋白B與槲皮素結(jié)合后的紫外-可見吸收光譜曲線Fig. 4 UV-Vis absorption spectra of β-lactoglobulin B and its complex with quercetin

2.3 熱力學(xué)參數(shù)分析

對(duì)于靜態(tài)猝滅，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以基于Stern-Volmer方程求得，結(jié)果見表1。槲皮素與β-乳球蛋白B的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）趨于1，因此判斷β-乳球蛋白B上只有一個(gè)槲皮素的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于結(jié)合常數(shù)Ka，從表1可以看出其數(shù)值隨著溫度升高而減小，表明槲皮素結(jié)合到β-乳球蛋白B上的反應(yīng)是放熱過程，這一點(diǎn)從ΔH小于0也可以判斷出來。

蛋白與小分子之間的相互作用力有4 種：靜電相互作用、疏水作用、范德華力和氫鍵。根據(jù)研究，在結(jié)合過程中，當(dāng)ΔH＞0、ΔS＞0時(shí)，疏水作用為主要作用力；當(dāng)ΔH＜0、ΔS＜0時(shí)，氫鍵和范德華力為主要作用力；當(dāng)ΔH＜0、ΔS＞0時(shí)，靜電相互作用為主要作用力[37]。根據(jù)表1計(jì)算的數(shù)據(jù)表明，范德華力和氫鍵為槲皮素和β-乳球蛋白B結(jié)合的主要作用力，后續(xù)的分子對(duì)接模擬也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。同時(shí)，該反應(yīng)的ΔG＜0，表明槲皮素和β-乳球蛋白B的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的[38]。

從圖5可以看出，二者之間的結(jié)合為放熱反應(yīng)，且該反應(yīng)熵變值小于0，同時(shí)其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)也趨于1。該結(jié)果與基于熒光猝滅利用Stern-Volmer方程計(jì)算出來的結(jié)果雖然數(shù)值上存在差異，但是在定性分析上保持了一致性，即β-乳球蛋白B上只有1 個(gè)槲皮素的結(jié)合位點(diǎn)，范德華力和氫鍵是槲皮素和β-乳球蛋白B結(jié)合的主要作用力。

表1 β-乳球蛋白B與槲皮素在不同溫度下相互作用的猝滅常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters of β-lactoglobulin B and quercetin interactions at different temperatures

圖5 槲皮素與β-乳球蛋白B的等溫滴定量熱圖Fig. 5 Isothermal titration calorimetry of quercetin and β-lactoglobulin B

2.4 同步熒光和三維熒光圖譜分析

同步熒光光譜可以研究配體對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，并提供有關(guān)熒光官能團(tuán)附近的分子微環(huán)境的信息。這使得可以縮小光譜帶并且同時(shí)檢索單個(gè)熒光團(tuán)上的信息而不是幾個(gè)熒光團(tuán)[31]。本實(shí)驗(yàn)分析不同掃描間隔下β-乳球蛋白B和槲皮素結(jié)合物的同步熒光特性。當(dāng)波長(zhǎng)間隔保持在15 nm或60 nm時(shí)，同步熒光提供了Trp殘基的特征信息：槲皮素的存在改變了Trp殘基附近的微環(huán)境，從而導(dǎo)致Trp的發(fā)射熒光減弱，使得β-乳球蛋白B出現(xiàn)了熒光猝滅[39]。因此推斷槲皮素的結(jié)合位點(diǎn)在Trp殘基附近，后續(xù)的分子對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證了這一推測(cè)。

三維熒光光譜是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的詳細(xì)信息的有效工具[36]。如圖6所示，峰a與Trp殘基的光譜特征有關(guān)；峰b主要揭示多肽骨架結(jié)構(gòu)的熒光光譜行為，其強(qiáng)度與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)；峰c是瑞利散射峰，另一峰是二階瑞利散射峰[40]。從圖6可以觀察到，熒光峰a和b在加入槲皮素后發(fā)生了猝滅。此結(jié)果表明，槲皮素可能與β乳球蛋白相互作用并引起其構(gòu)象和二級(jí)結(jié)構(gòu)的一些變化。

Jia Jingjing等[32]利用三維熒光圖譜分析β-乳球蛋白與多酚結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，引起的a、b兩峰的猝滅程度的大小依次為表沒食子兒茶素沒食子酸酯＞阿魏酸＞綠原酸，而三者含有的酚羥基的數(shù)目也是依次減少，推測(cè)a、b兩峰的猝滅程度可能與多酚中酚羥基的數(shù)目有關(guān)。槲皮素中也含有較多的酚羥基（5 個(gè)），因此也引起β-乳球蛋白B的a、b兩峰發(fā)生較大程度的猝滅，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。推測(cè)，β-乳球蛋白與多酚結(jié)合后二級(jí)結(jié)構(gòu)變化程度的大小與多酚中含有的酚羥基數(shù)目有關(guān)，酚羥基數(shù)目越多發(fā)生的變化越明顯。但這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖6 β-乳球蛋白B（A）以及β-乳球蛋白B結(jié)合槲皮素之后（B）的三維熒光圖譜Fig. 6 Excitation-emission matrix (EEM) fl uorescence spectra of β-lactoglobulin B (A) and its complex with quercetin (B)

2.5 結(jié)構(gòu)變化分析

FTIR常用來測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，位于1 600～1 700 cm－1之間的酰胺I帶，對(duì)于研究蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)最有價(jià)值[41]。因此，本研究通過對(duì)酰胺I帶的峰進(jìn)行擬合推測(cè)β-乳球蛋白B二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，通常情況下1 600～1 639 cm－1之間的峰為β-折疊的特征峰，1 640～1 650 cm－1為無規(guī)卷曲的特征峰，1 651～1 660 cm－1為α-螺旋的特征峰，1 661～1 700 cm－1為β-轉(zhuǎn)角的特征峰[42]。從圖7可以看出，在與槲皮素結(jié)合后，β-乳球蛋白B的擬合峰發(fā)生了明顯變化。與結(jié)合前相比，位于1 600～1 639 cm－1范圍內(nèi)的峰明顯增多，而位于1 651～1 660 cm－1范圍內(nèi)的峰則減少，這說明，結(jié)合槲皮素后β-乳球蛋白B中的α-螺旋含量降低，反之β-折疊含量增加，由表2可看出，α-螺旋減少了4.46%，β-折疊增加了3.59%。因此推測(cè)，槲皮素的結(jié)合使得部分α-螺旋解螺旋變?yōu)棣?折疊。這與Jia Jingjing等[32]用β-乳球蛋白結(jié)合沒表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸和阿魏酸所得的結(jié)果相一致，即與多酚的結(jié)合誘導(dǎo)β-乳球蛋白中的α-螺旋解螺旋變?yōu)棣?折疊。

由于FTIR峰值的擬合誤差較大，因此進(jìn)一步用CD光譜研究了β-乳球蛋白B二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)紫外（178～250 nm）CD光譜，反映了蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象信息[43]。利用CDpro軟件對(duì)未結(jié)合和結(jié)合了槲皮素的β-乳球蛋白B的遠(yuǎn)紫外CD光譜進(jìn)行分析，獲得了表2中蛋白質(zhì)各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量信息，從表2可以看出，槲皮素的結(jié)合使得β-乳球蛋白B中的α-螺旋含量降低，β-折疊含量增大，與FTIR的結(jié)果一致。因此判斷，槲皮素的結(jié)合誘導(dǎo)了β-乳球蛋白B中的α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變。

表2 未結(jié)合和結(jié)合槲皮素的β-乳球蛋白B的CD和FTIR光譜參數(shù)Table 2 CD and FTIR spectral parameters of β-lactoglobulin B and its complex with quercetin

圖7 β-乳球蛋白B（A）以及β-乳球蛋白B結(jié)合槲皮素之后（B）的FTIR光譜峰值擬合曲線Fig. 7 FTIR spectral peak fi tting of β-lactoglobulin B (A) and its complex with quercetin (B)

2.6 分子對(duì)接結(jié)果分析

使用Autodock軟件模擬β-乳球蛋白B和槲皮素的精確結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將10 個(gè)可能的結(jié)合構(gòu)象簇進(jìn)行對(duì)比，選擇其中自由能最低的構(gòu)象進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8、9所示。根據(jù)該對(duì)接結(jié)果，槲皮素結(jié)合在由一段α-螺旋和一段β-轉(zhuǎn)角組成的空穴中，且該結(jié)合位點(diǎn)附近有一個(gè)Trp殘基（Trp 19，圖8中紅色細(xì)線顯示）存在。此構(gòu)象中槲皮素和蛋白的結(jié)合能為4.54 MeV，氫鍵長(zhǎng)度為2.019 ?。其中有8 個(gè)氨基酸殘基（Lys100、Lys101、Val123、Arg124、Thr125、Glu127、Asp129）參與了槲皮素與β-乳球蛋白B的結(jié)合，其中蘇氨酸殘基（Thr125）與槲皮素的3號(hào)碳原子上的活性羥基氧之間形成了氫鍵（2.019 ?），其余的氨基酸殘基則提供了范德華力。這一結(jié)果也解釋了蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的原因，α-螺旋上的部分氨基酸參與了與槲皮素的結(jié)合，由于槲皮素具有疏水性，二者結(jié)合之后，在疏水作用下部分α-螺旋發(fā)生了變化。同時(shí)由于疏水作用導(dǎo)致Trp殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了變化，這也解釋了熒光猝滅和紫外-可見吸收光譜吸收峰發(fā)生紅移的原因。

根據(jù)Liang Li等[44]的報(bào)道，β-乳球蛋白上有5 個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)，分別為β-桶型結(jié)構(gòu)內(nèi)的疏水孔穴、α-螺旋和β-桶型結(jié)構(gòu)間表面疏水袋、Trp19-Arg124附近的外表面、β-桶型結(jié)構(gòu)的孔縫處以及二聚體的單體結(jié)合界面。由分子對(duì)接的結(jié)果可以看出，槲皮素與β-乳球蛋白B的結(jié)合位點(diǎn)正好是這5 個(gè)潛在位點(diǎn)中的一個(gè)，即Trp19-Arg124附近的外表面。這與Liang Li等[45]報(bào)道的白藜蘆醇的結(jié)合位點(diǎn)相似，根據(jù)其報(bào)道結(jié)合在該位點(diǎn)的白藜蘆醇的溶解性明顯增加。因此推測(cè)，結(jié)合β-乳球蛋白B后槲皮素的溶解性能也會(huì)明顯提升。

圖8 槲皮素與β-乳球蛋白B結(jié)合位點(diǎn)圖Fig. 8 Binding sites between quercetin and β-lactoglobulin B

圖9 氨基酸殘基與槲皮素的相互作用Fig. 9 Interaction of amino acid residues with quercetin

2.7 溶解度變化分析

將3.75 μg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋100 倍樣品的液相色譜進(jìn)行對(duì)比（圖10），發(fā)現(xiàn)二者峰形和保留時(shí)間保持一致。以槲皮素質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性分析，得到方程：Y=1.33×105X＋1.45×105，R2=0.999 8。同時(shí)進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，槲皮素在質(zhì)量濃度為0.95～30 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。將稀釋100 倍樣品的峰面積值代入該公式，得到稀釋后樣品中槲皮素質(zhì)量濃度為1.66 μg/mL，因此原樣中槲皮素質(zhì)量濃度為166 μg/mL。槲皮素在水溶液中的溶解度為0.09 μg/mL[23]。所以，β-乳球蛋白B的結(jié)合使槲皮素溶解度增大至原來的1 844 倍左右。

圖10 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（A）和結(jié)合β-乳球蛋白B后的槲皮素（樣品）（B）的色譜峰Fig. 10 Chromatographic peaks of quercetin standard (A) and quercetin-β-lactoglobulin B complex (B)

目前用于包埋槲皮素提高其水溶解性的主要材料是β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精。根據(jù)庫爾班江·巴拉提[46]的報(bào)道，β-環(huán)糊精包埋后槲皮素的溶解度為26.94 μg/mL，羥丙基-β-環(huán)糊精包埋后槲皮素的溶解度為2 224.21 μg/mL。通過對(duì)比可知，β-乳球蛋白B對(duì)槲皮素的增溶作用高于β-環(huán)糊精，低于由β-環(huán)糊精改性獲得的羥丙基-β-環(huán)糊精。這也提供了一個(gè)新思路，如果將β-乳球蛋白B進(jìn)行改性，其對(duì)槲皮素的增溶作用是否會(huì)發(fā)生大幅度地提高，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，槲皮素可在氫鍵和范德華力的共同作用下牢固地結(jié)合到β-乳球蛋白B中的潛在結(jié)合位點(diǎn)Trp19-Arg124附近的外表面上。在結(jié)合的過程中，由于槲皮素的疏水性，以及它與蛋白之間的相互作用，導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)附近的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境發(fā)生了變化，誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)處部分的α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊，并且使得結(jié)合位點(diǎn)暴露在一個(gè)更加疏水的微環(huán)境中。在與β-乳球蛋白B結(jié)合之后，槲皮素的水溶性得到了很大的提升，增大至原來的1 844 倍左右，其原因是β-乳球蛋白B的包埋使得槲皮素在水溶液中受到的疏水作用減小，因此β-乳球蛋白B可作為槲皮素的載體用于增大槲皮素的水溶性，這為研究槲皮素抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物機(jī)理提供參考依據(jù)。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)了槲皮素與β-乳球蛋白B的結(jié)合機(jī)制，但是并未對(duì)結(jié)合β-乳球蛋白B后槲皮素的生理活性做進(jìn)一步研究。目前在一些細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白的水解產(chǎn)物具有降低膽固醇和抗氧化等生理活性[47]，槲皮素也具有抗氧化、降血脂、抑制AGEs[2]等一系列生理活性，而槲皮素在與β-乳球蛋白B的結(jié)合過程中只損失了一個(gè)羥基，其余活性的羥基并未受影響，因此推測(cè)在與β-乳球蛋白B結(jié)合后槲皮素的抗氧化活性、抑制AGEs的活性并未受降低，反而是得到了β-乳球蛋白B的保護(hù)，并且二者的結(jié)合物同時(shí)具有降血脂和降低膽固醇的生理活性。這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)也為后續(xù)的研究提供了一個(gè)切入點(diǎn)。