閆博文，楊化宇，蔡一芥，范大明，連惠章，陳 衛(wèi)，張 灝，趙建新,*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.蘇州旅游與財(cái)經(jīng)高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 蘇州 215104；4.無錫華順民生食品有限公司，江蘇 無錫 214218）

饅頭作為我國傳統(tǒng)發(fā)酵主食擁有悠久歷史，且深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。隨著工業(yè)水平的不斷發(fā)展與進(jìn)步，饅頭的發(fā)酵主要采用即發(fā)型活性酵母粉，其具有發(fā)酵速率快且產(chǎn)品批次穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。然而，我國山東和河南等北方地區(qū)，仍傳承著傳統(tǒng)酸面團(tuán)發(fā)酵工藝，制得饅頭產(chǎn)品風(fēng)味濃郁，質(zhì)地更佳，始終是消費(fèi)者的第一選擇[2-3]。這主要是由于酸面團(tuán)發(fā)酵過程中伴隨著內(nèi)源性谷物蛋白酶對(duì)大分子蛋白質(zhì)聚合物的降解作用，產(chǎn)生大量的游離氨基酸，而酸面團(tuán)中微生物可通過自身代謝將其生成具有改善產(chǎn)品風(fēng)味的活性物質(zhì)[4]。研究表明乳酸菌可代謝合成具有濃厚味（Kokumi）的滋味活性肽，此類物質(zhì)可有效提高產(chǎn)品的滋味特性，如甜味、咸味以及酸味等，對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)有積極的作用[5-6]。

谷胱甘肽作為一種γ-谷氨酰三肽，是最早被發(fā)現(xiàn)具有濃厚味的活性滋味肽，其主要來源于酵母提取物和部分谷物[7]。谷胱甘肽的合成主要與酵母菌的自溶以及谷胱甘肽合成酶有關(guān)，且研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)帕爾馬干酪的滋味提升有重要作用[8-9]。然而，谷胱甘肽在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的作用下，可生成多種γ-谷氨酰二肽，其是一類具有濃厚味的滋味活性二肽，其滋味閾值在0.005～0.01 μmol/kg[5]，廣泛存在于奶酪、醬油和酸面團(tuán)等發(fā)酵制品中[8,10-11]。由于其滋味閾值較低，且具有改善發(fā)酵產(chǎn)品滋味特性的潛在能力，因此近年來受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。Zhao等[10]采用羅伊氏乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)觀察其對(duì)γ-谷氨酰二肽合成的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝合成γ-谷氨酰二肽存在株間水平差異。然而，針對(duì)酸面團(tuán)中常見的不同乳酸菌菌種對(duì)γ-谷氨酰二肽代謝合成能力的相關(guān)研究尚鮮見報(bào)道，且含有不同生成量γ-谷氨酰二肽的饅頭制品在滋味上的差異性尚不明確。因此，本研究采用分離自酸面團(tuán)中的常見乳酸菌發(fā)酵，觀察比較不同乳酸菌在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中對(duì)γ-谷氨酰二肽合成量的種間水平差異，及其對(duì)產(chǎn)品滋味特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅伊氏乳桿菌分離自酸面團(tuán)，受贈(zèng)于加拿大阿爾伯塔大學(xué)；發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、食竇魏斯氏乳桿菌、舊金山乳桿菌分離自酸面團(tuán)，江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心保藏；即發(fā)型活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；小麥粉 加拿大Robin Hood公司；γ-谷氨酰二肽分析純標(biāo)準(zhǔn)品（γ-谷氨酰谷氨酸、γ-谷氨酰纈氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸和γ-谷氨酰亮氨酸）由美國生物公司合成制備。

1.2 儀器與設(shè)備

SM-25攪面機(jī)、SK-12P醒發(fā)箱 新麥機(jī)械（無錫）有限公司；HB24D552W電蒸箱 博西家用電器（中國）有限公司；高效液相色譜、液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；Smart Tongue電子舌系統(tǒng) 上海瑞玢智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與酸面團(tuán)的制備

將－80 ℃保菌管內(nèi)菌液進(jìn)行菌落劃線，置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單菌落接種至1 mL mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，活化2 代，備用。取500 μL乳酸菌發(fā)酵液接種至50 mL mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，得到菌液6 000×g離心10 min，去上清液，加入等體積生理鹽水洗滌菌泥2 次，而后加入無菌水50 mL和小麥粉50 g，混勻，37 ℃培養(yǎng)48 h，制得酸面團(tuán)備用[12]?；瘜W(xué)酸化面團(tuán)，即在面團(tuán)制備過程中添加乳酸和乙酸混合溶液（體積比4∶1），調(diào)節(jié)初始面團(tuán)pH 3.5。

1.3.2 酸面團(tuán)pH值和微生物菌落總數(shù)的測(cè)定

采用酸面團(tuán)中分離篩選得到的5 株常見乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)，并對(duì)其pH值和菌落總數(shù)進(jìn)行比較分析。稱取10 g酸面團(tuán)樣品，加入90 mL蒸餾水，攪拌20 min，靜置5 min，測(cè)定酸面團(tuán)pH值；稱取10 g酸面團(tuán)樣品，加入90 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)機(jī)拍打10 min，通過梯度稀釋，涂布，厭氧培養(yǎng)，測(cè)定酸面團(tuán)中微生物菌落總數(shù)[13]。

1.3.3 酸面團(tuán)中游離氨基酸總量的測(cè)定

游離氨基酸是γ-谷氨酰二肽的重要合成底物，采用不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)考察其對(duì)游離氨基酸總量的影響。稱取酸面團(tuán)樣品10 g，加入5%三氯乙酸溶液50 mL，高速勻漿1 min，再以10 000 r/min離心10 min，將上清液用兩層濾紙過濾，濾液以10 000 r/min離心10 min后用鄰苯二醛進(jìn)行柱前衍生，然后高效液相色譜進(jìn)樣進(jìn)行游離氨基酸分析，每個(gè)樣品至少重復(fù)2 次操作[14]。

色譜條件：采用ODS Hypersil毛細(xì)管色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為20 mmol/L乙酸鈉的甲醇-乙腈溶液（體積比1∶2），設(shè)置流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，紫外檢測(cè)器波長338 nm。

1.3.4 面團(tuán)模擬體系和酸面團(tuán)中γ-谷氨酰二肽含量的測(cè)定

采用面團(tuán)模擬體系對(duì)乳酸菌發(fā)酵合成γ-谷氨酰二肽進(jìn)行初步的驗(yàn)證。面團(tuán)模擬體系參考Zhao等[10]的方法：將活化后的乳酸菌菌液接種至緩沖鹽溶液中，37 ℃培養(yǎng)24 h。其中緩沖鹽溶液中含有5 g/L麥芽糖和10 g/L氨基酸混合溶液（谷氨酰、胺谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸）。為驗(yàn)證乳酸菌菌種是否可自身轉(zhuǎn)化生成γ-谷氨酰二肽，將活化后的乳酸菌菌液接種至無氨基酸底物的緩沖鹽溶液中進(jìn)行分析比較。分別取0 h和發(fā)酵24 h后的模擬緩沖溶液，離心，過濾，濾液用于液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜分析γ-谷氨酰二肽的含量。

采用C18高效液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液，洗脫速率0.2 mL/min，設(shè)置程序：0～10 min，95%～75% A；10～15 min，75%～0% A；15～25 min，0%～95% A；平衡10 min。采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)的方法對(duì)γ-谷氨酰二肽進(jìn)行檢測(cè)分析，4 種目標(biāo)物質(zhì)離子對(duì)參數(shù)見表1。將標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇-水-甲酸溶液（30∶69.9∶0.1，V/V）中，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算。其中，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.1～100 μg/L。

表1 γ-谷氨酰二肽在液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜中測(cè)定參數(shù)Table 1 LC-MS/MS parameters for detection of γ-GPs

1.3.5 酸面團(tuán)發(fā)酵饅頭樣品的制備

制備500 g面團(tuán)，酸面團(tuán)發(fā)酵組和空白對(duì)照組配方見表2。將配料置于攪面機(jī)中先慢速攪拌4 min，再快速攪拌3.5 min，將成型面團(tuán)取出，切分成80 g/個(gè)，手工搓圓，置于醒發(fā)箱內(nèi)，35 ℃、相對(duì)濕度85%條件下發(fā)酵50 min。醒發(fā)結(jié)束后，將面團(tuán)置于電蒸箱內(nèi)，100 ℃加熱20 min，室溫冷卻，備用。

表2 饅頭制作配方Table 2 Steamed bread recipes

1.3.6 基于電子舌對(duì)酸面團(tuán)發(fā)酵饅頭滋味特性的測(cè)定

根據(jù)何曉赟[15]的方法，并適當(dāng)修改：稱取不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)制得的饅頭100 g，粉碎，并加入300 mL去離子水，高速勻漿1 min后，置于離心機(jī)中3 000×g離心10 min，取上清液。量取上清液100 mL，數(shù)據(jù)采集中以清洗液（蒸餾水）和待測(cè)樣品萃取液交替進(jìn)行，為使傳感器響應(yīng)值趨于平穩(wěn)，每個(gè)樣品采集時(shí)間為120 s，每隔1 s采集一個(gè)數(shù)據(jù)，采集完畢清洗20 s。為減少測(cè)量誤差，本試驗(yàn)取最后10 s測(cè)量值的平均值作為各傳感器的后續(xù)處理數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

研究數(shù)據(jù)處理均采用Origin 8.0軟件分析作圖，SAS 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，采用ANOVA方法進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。結(jié)果均為3 次實(shí)驗(yàn)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)的理化特性

由表3可知，不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)48 h后pH值均可達(dá)到3.50左右，菌落總數(shù)可達(dá)到108CFU/g以上。酸面團(tuán)pH值的降低主要是由于乳酸菌生長代謝產(chǎn)生的乳酸等有機(jī)酸成分積累造成[16]。然而，過多的H＋和有機(jī)酸組分對(duì)菌株的生成代謝有強(qiáng)烈的抑制作用[17]。因此，不同乳酸菌在長時(shí)間酸面團(tuán)發(fā)酵過程中，pH值和菌落總數(shù)在菌種間并無顯著性差異。

表3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)酸面團(tuán)pH值和菌落總數(shù)的影響Table 3 Effect of various lactobacilli on pH and total bacterial count of sourdough

2.2 乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)對(duì)游離氨基酸總量的影響

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)的游離氨基酸總量Fig. 1 Effect of various lactobacilli on the total content of free amino acids in sourdough

如圖1所示，與化學(xué)酸化相較，乳酸菌發(fā)酵可顯著提高面團(tuán)中游離氨基酸總量。在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中，由于谷物中的氮源主要以無機(jī)形式存在，乳酸菌自身蛋白水解系統(tǒng)無法利用，對(duì)此類氮源的降解能力較為有限[18]。其主要是通過乳酸菌代謝產(chǎn)酸創(chuàng)造的低酸環(huán)境激活谷物中的內(nèi)源性蛋白酶，進(jìn)而促進(jìn)小麥粉中大分子蛋白聚合物的降解，產(chǎn)生大量的游離氨基酸[19]。乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)是一個(gè)緩釋酸化的過程，谷物蛋白酶最適pH 4.0，而化學(xué)酸化面團(tuán)pH值始終保持在3.5左右，因此面團(tuán)中游離氨基酸總量顯著低于乳酸菌發(fā)酵組[20]。此外，結(jié)果還表明不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)中游離氨基酸總量存在顯著差異，這主要是由于乳酸菌對(duì)面團(tuán)中小分子蛋白，如清蛋白、球蛋白和谷蛋白等，具有良好的水解能力[21]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)乳酸菌對(duì)小分子蛋白質(zhì)的水解能力存在種間差異性，進(jìn)而導(dǎo)致面團(tuán)中游離氨基酸總量存在顯著差異性，這也為γ-谷氨酰二肽的生成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 酸面團(tuán)模式體系下乳酸菌對(duì)γ-谷氨酰二肽合成的影響

基于酸面團(tuán)中游離氨基酸單體含量的比較，本研究選擇將γ-谷氨酰谷氨酸、γ-谷氨酰纈氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸和γ-谷氨酰亮氨酸作為γ-谷氨酰二肽代表性目標(biāo)產(chǎn)物，用于闡明乳酸菌對(duì)γ-谷氨酰二肽合成的影響。首先，乳酸菌接種在無游離氨基酸模擬溶液中，γ-谷氨酰二肽并未檢出，由此說明乳酸菌在無外源底物的情況下，通過自身代謝無法生成γ-谷氨酰二肽。而由圖2可知，不同乳酸菌對(duì)γ-谷氨酰二肽的合成存在種間差異性，其中羅伊氏乳桿菌發(fā)酵合成γ-谷氨酰二肽含量最高。根據(jù)γ-谷氨酰二肽單體合成量的比較可以發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌發(fā)酵液中γ-谷氨酰谷氨酸和γ-谷氨酰異亮氨酸合成量顯著高于γ-谷氨酰亮氨酸和γ-谷氨酰纈氨酸。Zhao等[10]在比較同種不同株水平上羅伊氏乳桿菌對(duì)γ-谷氨酰二肽代謝合成的影響中也得到了類似的結(jié)果。由此可推測(cè)乳酸菌在利用游離氨基酸合成γ-谷氨酰二肽時(shí)存在選擇性的差異，其通過自身代謝酶系優(yōu)先選擇谷氨酸和異亮氨酸用于相應(yīng)γ-谷氨酰二肽的合成。針對(duì)乳酸菌合成γ-谷氨酰二肽的形成過程，現(xiàn)有研究認(rèn)為主要與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以及谷胱甘肽合成酶有關(guān)[22-23]。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶均與谷胱甘肽的合成有關(guān)，而谷胱甘肽可通過γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶生成不同的γ-谷氨酰二肽類物質(zhì)[24]?；贜CBI數(shù)據(jù)庫，將γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調(diào)控基因序列與不同種乳酸菌的基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除舊金山乳桿菌以外，本實(shí)驗(yàn)所用乳酸菌均含有1～3 個(gè)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調(diào)控基因[25]。然而，Kai等[26]的報(bào)道顯示舊金山乳桿菌中含有谷胱甘肽合成酶，這可能與其代謝合成γ-谷氨酰二肽有重要的關(guān)系。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)酸面團(tuán)模擬體系中γ-谷氨酰二肽含量的影響Fig. 2 Effect of various Lactobacillus strains on the concentration of γ-glutamyl dipeptides in buffer-based model dough

2.4 乳酸菌發(fā)酵對(duì)酸面團(tuán)中γ-谷氨酰二肽含量的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證乳酸菌發(fā)酵面團(tuán)對(duì)γ-谷氨酰二肽合成的影響，采用不同種乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)比較發(fā)酵過程中γ-谷氨酰二肽的合成量。由表4所示，發(fā)酵初始階段，面團(tuán)中可測(cè)得少量的γ-谷氨酰谷氨酸、γ-谷氨酰異亮氨酸和γ-谷氨酰亮氨酸，而γ-谷氨酰纈氨酸并未檢出，這可能與小麥粉中谷氨酸含量較高有關(guān)[27]。酸面團(tuán)經(jīng)過48 h發(fā)酵后（表5），4 種γ-谷氨酰二肽均增加，且γ-谷氨酰谷氨酸和γ-谷氨酰異亮氨酸合成量增加更為顯著，這一結(jié)果與面團(tuán)模擬發(fā)酵液所得到的結(jié)果一致。由γ-谷氨酰二肽總量可知，羅伊氏乳桿菌具有更優(yōu)的γ-谷氨酰二肽合成能力，再次驗(yàn)證了乳酸菌在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中對(duì)于γ-谷氨酰二肽的合成存在種間差異性。此外，采用額外添加蛋白酶的方式，通過提高面團(tuán)體系中游離氨基酸總量，觀察4 種γ-谷氨酰二肽含量的變化（數(shù)據(jù)未列出）。結(jié)果表明，游離氨基酸底物濃度的增加可有效促進(jìn)4 種γ-谷氨酰二肽的合成量，由此說明γ-谷氨酰二肽的合成與發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解程度有緊密的關(guān)系。

表4 不同乳酸菌發(fā)酵0 h對(duì)酸面團(tuán)中γ-谷氨酰二肽濃度的影響Table 4 Effect of various Lactobacillus strains on the concentration of γ-glutamyl dipeptides in unfermented sourdough μmol/L

表5 不同乳酸菌發(fā)酵48 h對(duì)酸面團(tuán)中γ-谷氨酰二肽濃度的影響Table 5 Effect of various Lactobacillus strains on the concentration of γ-glutamyl dipeptides in 48 h fermented sourdough μmol/L

2.5 乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)制備饅頭樣品的電子舌滋味分析

研究表明，具有濃厚味的活性物質(zhì)可有效提高產(chǎn)品的其他滋味強(qiáng)度，如酸味、鮮味和咸味等，進(jìn)而顯著改善提升產(chǎn)品的滋味特性。為進(jìn)一步驗(yàn)證乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)代謝合成γ-谷氨酰二肽對(duì)饅頭滋味特性的影響，研究采用電子舌對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)制得饅頭的滋味特性進(jìn)行分析比較，由圖3可知，與空白對(duì)照組相較，乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)制得饅頭在酸味、鮮味和咸味上存在顯著差異。乳酸菌發(fā)酵可代謝積累乳酸等有機(jī)酸成分，因此制得產(chǎn)品相較空白組酸味顯著增強(qiáng)。其中，由于植物乳桿菌生長速率快，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，因此其制得產(chǎn)品酸味值較高[28]。針對(duì)咸味方面，由于產(chǎn)品配方中并未添加任何咸味成分，其咸味可能與發(fā)酵過程中代謝形成的咸味氨基酸或小分子肽有關(guān)[29-30]。然而，通過與空白組比較，結(jié)合不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)對(duì)γ-谷氨酰二肽合成量的分析發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵過程中γ-谷氨酰二肽合成量最高，其制得產(chǎn)品咸味值也是最強(qiáng)的。由此推斷，γ-谷氨酰二肽與饅頭咸味的增強(qiáng)有一定的聯(lián)系。隨著消費(fèi)者對(duì)低鈉攝入健康飲食的不斷推崇，這為乳酸菌發(fā)酵高產(chǎn)γ-谷氨酰二肽制備低鈉發(fā)酵食品奠定了理論基礎(chǔ)，也為米面發(fā)酵食品優(yōu)質(zhì)菌種的篩選提供了理論依據(jù)。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)制得饅頭滋味特性的比較Fig. 3 Effect of sourdough fermented by various Lactobacillus strains on the taste of steamed bread

3 結(jié) 論

研究表明，不同乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)均可通過自身代謝合成γ-谷氨酰二肽，但在發(fā)酵過程中對(duì)合成底物具有優(yōu)先選擇性，且其代謝合成量種間存在顯著差異。在酸面團(tuán)常見發(fā)酵菌種中，羅伊氏乳桿菌合成γ-谷氨酰二肽能力最優(yōu)。此外，舊金山乳桿菌雖然不含γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，但仍可代謝合成γ-谷氨酰二肽，說明γ-谷氨酰二肽的代謝調(diào)控可能與γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶有關(guān)。電子舌分析數(shù)據(jù)表明，γ-谷氨酰二肽可顯著提升產(chǎn)品的咸味強(qiáng)度，有效提升產(chǎn)品的滋味特性，這也為酸面團(tuán)發(fā)酵制得饅頭產(chǎn)品風(fēng)味濃郁提供了新的理論佐證。