徐永良，孫平，李明秋，趙微

牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157000

研究報(bào)道，腫瘤擴(kuò)散主要是通過腫瘤細(xì)胞通過淋巴管向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而實(shí)現(xiàn)的[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的不斷發(fā)展，腫瘤血管生成抑制劑研究實(shí)現(xiàn)了由實(shí)驗(yàn)階段向臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)變，取得了一定的成果。尤其是特異性人真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物（HDLEC）被發(fā)現(xiàn)，將腫瘤與新生淋巴管研究又推向了一個(gè)新的階段，該研究有望為抗腫瘤新生淋巴管治療提供更多的可能性，推動(dòng)腫瘤生物治療新模式的發(fā)展[2]。當(dāng)前，關(guān)于淋巴管生成過程及機(jī)制尚不明確。作為治療腫瘤疾病的傳統(tǒng)中藥，去甲斑蝥素（NCTD）抗淋巴管生成作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究[3]。該次研究采用HDLEC三維培養(yǎng)對(duì)淋巴管生成過程進(jìn)行模擬，探究其對(duì)淋巴管生成因子以及基因表達(dá)的影響，總結(jié)其抗淋巴管生成的分子機(jī)制，以期為腫瘤抗淋巴管生成治療的實(shí)現(xiàn)提供可靠的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究所用HDLEC細(xì)胞購自通派(上海)生物科技有限公司；人纖維蛋白原購自深圳市衛(wèi)武光明生物制品有限公司；兔抗人VEGF-C抗體由上海萬疆生物技術(shù)有限公司提供，見表1。

表1 材料及試劑來源情況

1.2 纖維蛋白凝膠的制備及細(xì)胞培養(yǎng)

選擇3 mg/mL人纖維蛋白原與50 U/mL人凝血酶，采用PBS進(jìn)行溶解，纖維蛋白凝膠的制備在6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，分別在其中按照先后順序加入500 μL纖維蛋白原、100 μL內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液以及10 μL凝血酶溶液，凝固后，在37℃溫度環(huán)境下，將上述放置于95%空氣飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間以30 min為宜，直至纖維蛋白原凝膠呈現(xiàn)為膠凍狀。提取300 μL培養(yǎng)好的HDLEC懸液注入凝膠表面，在室溫狀態(tài)下靜置1 h，然后在其中加入2 mL內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為95%空氣飽和濕度、5%CO2，溫度以37℃為宜，進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換，采用倒置光顯微鏡對(duì)細(xì)胞生長情況以及體外淋巴管予以觀察，并做好相應(yīng)的記錄。培養(yǎng)1周左右，將HDLEC隨機(jī)分為NCTD組與空白對(duì)照組，其中NCTD組加入1/3IC50NCTD40nM，持續(xù)培養(yǎng)24 h，記錄其形態(tài)變化情況。對(duì)HDLEC進(jìn)行1周培養(yǎng)，然后隨機(jī)分為NCTD組與空白對(duì)照組，24 h后對(duì)HDLEC體外模擬淋巴管生成情況予以免疫細(xì)胞化學(xué)檢測、Westen blot以及qPCR測定。

1.3 qPCR檢測

嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說明進(jìn)行檢測，首先將細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，在cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒指導(dǎo)作用下，完成第一鏈cDNA的合成，然后實(shí)施PCR擴(kuò)增，并給予定量PCR 檢測。 擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃30 s，前后共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用北京豫維科技有限公司提供的Verilog序列檢測系統(tǒng)自帶軟件，所有檢測樣品均配備兩份。樣本mRNA相對(duì)表達(dá)量以及測定CT值內(nèi)部參照選擇GAPDH，基因表達(dá)量的計(jì)算采用比較循環(huán)閾值的方法。

1.4 Western blot試驗(yàn)

按照試劑盒說明實(shí)施操作，將細(xì)胞進(jìn)行裂解，并將蛋白提取，放置于RIPA裂解緩沖液中，其中包含了1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉、50 mM Tris以及150 mM氯化鈉，對(duì)兔抗人VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3抗體實(shí)施免疫印跡試驗(yàn)。蛋白條帶顯示采用Licor Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)（北京恒安瑞豐科技有限公司）。在計(jì)算與GAPDH相對(duì)的熒光強(qiáng)度時(shí)采用的是Odyssey軟件。VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)積分光密度采用Image Pro Plus軟件予以確定。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

采用S-P法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。首先于玻璃蓋玻片上放置浸漬35 mm培養(yǎng)皿纖連蛋白，然后再蓋玻片上接種HDLEC。將其隨機(jī)分為NCTD組與空白對(duì)照組，作用時(shí)間為24 h，將蓋玻片取出，按照1：1的比例對(duì)甲醇與丙酮溶液進(jìn)行固定，在常溫狀態(tài)下自然風(fēng)干，然后保存于-20℃冰箱環(huán)境中。按照S-P法的要求對(duì)細(xì)胞片實(shí)施免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)出棕黃色顆粒。采用Image Pro PLus對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行測定，記錄積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

研究所有數(shù)據(jù)采用SPPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件上進(jìn)行，所有計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（±s）表示，組間差異性用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCTD組與空白對(duì)照組淋巴管生成情況比較

空白對(duì)照組HDLEC細(xì)胞多以橢圓、圓形為主，NCTD組少部分為管狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞形態(tài)隨著時(shí)間延長表現(xiàn)為離壁、浮起。采用顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，取值3次，結(jié)果顯示NTCD組淋巴管生成個(gè)數(shù)較空白對(duì)照組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

表2 NCTD組與空白對(duì)照組淋巴管生成情況比較[（±s），個(gè)]

表2 NCTD組與空白對(duì)照組淋巴管生成情況比較[（±s），個(gè)]

組別淋巴管生成個(gè)數(shù)N C T D組空白對(duì)照組t值P值1 0.9 2±2.3 5 6 7.2 9±5.3 6 2 3.5 5 2<0.0 5

2.2 NCTD對(duì)淋巴管生成中 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的影響

經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western blot試驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)NCTD組三維培養(yǎng)淋巴管中的VEGF-C以及VEGF-D蛋白呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，且對(duì)VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表達(dá)呈現(xiàn)出降低趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3。

表3 NCTD對(duì)淋巴管生成中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的影響[（±s），%]

表3 NCTD對(duì)淋巴管生成中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達(dá)的影響[（±s），%]

組別 V E G F-C V E G F-D V E G F R-3 N C T D組空白對(duì)照組t值P值2.4 3±0.1 2 7.4 5±0.1 4 8.4 9 3<0.0 5 1 6.0 9±1.2 4 2 7.2 1±1.2 6 1 0.2 7 5<0.0 5 0.9 6±0.0 1 3.4 2±0.0 3 6.4 3 2<0.0 5

3 討論

研究顯示，淋巴管生成在胚胎期淋巴系統(tǒng)發(fā)育及淋巴管再生中發(fā)揮這極為重要的作用[4-5]。通常，血管生成與淋巴管生成是同步進(jìn)行的，當(dāng)腫瘤中有血管生成，可以判斷腫瘤中也或多或少含有淋巴管生成[6]。以往有學(xué)者在動(dòng)物模型中證實(shí)了腫瘤淋巴管的生成，且發(fā)現(xiàn)NCTD能夠?qū)δ懩壹鞍螂啄[瘤細(xì)胞VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用[7]。該次研究在完成構(gòu)建HDLEC體外培養(yǎng)淋巴管生成模型及功能化表征的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步采用生化分析及熒光檢測方法實(shí)時(shí)跟蹤藥物的活性效應(yīng)。在體外培養(yǎng)的淋巴管體系加入模型抗腫瘤藥物，進(jìn)行24 h藥物處理,參照傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)考察淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖（與未處理的細(xì)胞比較）和活性情況及淋巴管生成的影響。利用Western blot試驗(yàn)、免疫化學(xué)細(xì)胞染色檢測藥物的代謝過程進(jìn)行藥物分析，探討體內(nèi)過程影響藥物抑制淋巴管生成的機(jī)理，進(jìn)而完成基于淋巴管生成的抗腫瘤藥物評(píng)價(jià)，可以發(fā)現(xiàn)淋巴管狀結(jié)構(gòu)形成與HDLEC遷移、增殖等有著密不可分的聯(lián)系。學(xué)者袁小建等人[8]在研究中發(fā)現(xiàn)NCTD對(duì)HDLEC的形態(tài)和細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制和直接殺傷作用，并能促進(jìn)、誘導(dǎo)HDLEC凋亡，且0.001 25 mg/mL組越過刮除線細(xì)胞數(shù)達(dá)到（32.5±4.3）個(gè)，高于 0.005 mg/mL 組（56.3±5.2）個(gè)（P＜0.05），其作用隨 NCTD濃度而加強(qiáng) (P＜0.01)。從該次研究結(jié)果看，NCTD組淋巴管生成數(shù)量少于空白對(duì)照組[（10.92±2.35）個(gè)vs（67.29±5.36）個(gè)]，且隨著時(shí)間延長 HDLEC 細(xì)胞呈現(xiàn)出浮起、固縮碎裂等，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死現(xiàn)象，證實(shí)了NCTD對(duì)HDLEC三維培養(yǎng)體外模擬淋巴管生成的抑制作用，與此同時(shí)，NCTD還能夠抑制已經(jīng)形成的淋巴管狀結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行破壞，與以往學(xué)者研究結(jié)果一致。盡管當(dāng)前NCTD在臨床上已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療，然而其在抗腫瘤淋巴管生成方面卻鮮有報(bào)道[9]。該次研究構(gòu)建了HDLEC體外模擬淋巴管生成模型，采用Wesren bolt qPCR等檢測，結(jié)果顯示NCTD能夠?qū)α馨凸苌善陂g的VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表達(dá)起到下調(diào)作用，考慮與NCTD對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移作用有關(guān)[10]。但NCTD能夠?qū)盒阅[瘤引起的淋巴管生成起到抑制作用還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。在今后研究中可著重探討NCTD與VEGFR-3抗體在腫瘤淋巴管生成中是否存在協(xié)同作用，為腫瘤抗淋巴管治療提供借鑒。

綜上所述，NCTD能抑制 HDLEC的增殖、遷徙，并對(duì)其有直接殺傷作用和凋亡誘導(dǎo)作用，這可能是NCTD抗淋巴管生成作用的基礎(chǔ)。