董庭邦，王 磊，桂 瀟，蘇 燦，李 潔，黃勝雄*，王福生*

1大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671000；2中國科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201

放線菌(Actinomycetes)廣泛分布于土壤、海洋和湖泊等不同地自然生境中，它們與人類生活息息相關(guān)，在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品、化工和環(huán)保等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。迄今為止，近萬種被發(fā)現(xiàn)的天然抗生素中，約 70% 由放線菌產(chǎn)生，其中，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素約占52%[2]。Bafilomycins是具有16元內(nèi)酯環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，首次從灰色鏈霉菌的培養(yǎng)物中分離得到[3]。目前，從鏈霉菌中得到的Bafilomycins類化合物有Bafilomycin A～J及其衍生物，該大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對革蘭氏陽性菌具有廣譜的殺菌活性，并且具有抗寄生蟲的作用[4,5]。

在我國，玉米是僅次于水稻和小麥的第三大糧食作物以及多種農(nóng)副產(chǎn)品的原料，并且種植面積較大。近年來，玉米病蟲害日益嚴(yán)重，不僅影響了玉米的質(zhì)量和產(chǎn)量，而且玉米病害的不斷進(jìn)化和變異，加大了其防治難度和效果。為了尋找新的抗植物病原菌天然活性物質(zhì)，本課題組對多株鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)一株鏈霉菌KIB-H1556的粗提物對植物病原真菌顯示出較好的抑制活性。本實(shí)驗(yàn)對該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，采用活性追蹤的方法，對其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到3個(gè)化合物。首次發(fā)現(xiàn)化合物2和3對玉米大斑病菌、小斑病菌和玉米彎孢病菌等植物病原菌顯示有抑制活性，其具有作為抗植物病原真菌藥物的研究價(jià)值。

圖1 化合物1～3的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-3

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance Ⅲ-600型核磁共振儀(TMS作為內(nèi)標(biāo)，δ為ppm)，Agilent UPLC/Q-Tof液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 1290UPLC/6540 Q-TOF)，Hitachi Chromaster高效液相色譜儀(日立)，YMC-Triat C18型液相色譜柱(250 × 10 mm I.D.)，ZQZY-HC恒溫?fù)u床(上海知楚儀器)，薄層色譜硅膠板和200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(瑞典AIRTECH生物化學(xué)試劑公司)，YXQ-LS-18SI高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑(天津市大茂化學(xué)試劑廠，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.2 菌種及來源

發(fā)酵菌株：Streptomycessp.KIB-H1556分離自曼陀羅(DaturastramoniumL.)根際土壤，通過對其16S rRNA基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其序列與Streptomycesgriseobrunneusstrain NBRC 12775的序列相似度是99.9%。菌株KIB-H1556保藏于昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源可持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

測試菌株：番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Gibberellazeae)、玉米小斑病菌(HelminthosporiummaydisNisik & Miy)、棉花枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.f.sp.Vasinfectum)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum(Pass.) Leonard et Suggs)、水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn.)、玉米彎孢病菌(Curvularialunata(Walk) Boed)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Cucumerinum)和大豆根腐病菌(Fusariumoxysporum)由西北農(nóng)林科技大學(xué)馬亞團(tuán)老師提供。菌株目前保藏于昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源可持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)基：為MS培養(yǎng)基，大豆粉20.0 g，加入1.0 L水，煮沸15 min，用紗布過濾除去濾渣，濾液定容到1.0 L，加甘露醇20.0 g，技術(shù)瓊脂粉20.0 g，pH = 7.0。

種子培養(yǎng)基：為TSB培養(yǎng)基，配方為大豆蛋白胨3.0 g/L，胰蛋白胨17.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，pH = 7.3 ± 0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，甘油10.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，CaCO33.0 g/L，pH =7.0 ± 0.2。

PDA：200.0 g去皮土豆切碎，加入1.0 L水，煮沸30 min，用紗布過濾除去濾渣，濾液定容到1.0 L，加20.0 g葡萄糖，再加20.0 g瓊脂粉，攪拌溶解后滅菌待用。

將在MS平板上活化好的菌株接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm搖床上培養(yǎng)2天。將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接到盛有250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，共發(fā)酵20 L。置于28 ℃，220 rpm搖床上培養(yǎng)7天。

1.4 提取與分離

Streptomycessp.KIB-H1556發(fā)酵7天后，將發(fā)酵液于4 000 rpm下離心20 min。上清液用乙酸乙酯萃取3次；菌絲體用丙酮浸泡并超聲破碎后，蒸餾除去丙酮，剩余的水相用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相得萃取物5.3 g。該萃取物經(jīng)硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯50∶1,10∶1,5∶1,1∶1,0∶1)分離，將石油醚-乙酸乙酯(1∶1，0∶1)部分合并得F組分:560 mg。F組分用甲醇溶解后再經(jīng)過葡聚糖凝膠柱層析分離得到5個(gè)組分(F1-5)。F4組分用半制備HPLC分離(90%甲醇洗脫25 min)，富集4.58 min的流份得化合物 1(8.2 mg)，富集21.17 min的流份得化合物2(10.7 mg)，富集23.81 min的流份得化合物3(13.2 mg)。

1.5 活性測試

將九株測試菌分別接種至PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，28 ℃避光培養(yǎng)4天，待其菌落基本長滿培養(yǎng)皿為止即可使用?；衔?、2、3、Carbendazim、Cycloheximide和Nystatin均配制成濃度為2.0 mg/mL的甲醇溶液備用。超凈條件下，在長滿菌落的培養(yǎng)皿中加入無菌水，用滅菌過的竹簽把孢子加到離心管中，加入30 mL滅菌后的PDA，翻轉(zhuǎn)搖至均勻后倒入培養(yǎng)皿中。待冷卻后，十字線標(biāo)記。取無菌濾紙片(用打孔器將濾紙片加工成直徑為5 mm)，滴上5 μL樣品溶液，待溶劑揮干后移入已接菌的培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)皿中心到濾紙片中心的距離約為30 mm左右。將菌株放在28 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。測試時(shí)以無菌水和甲醇為陰性對照，以Carbendazim、Cycloheximide和Nystatin為陽性對照，每塊平板中都需有陽性對照[6]。重復(fù)平行做3次，抑菌圈直徑測量3次求其平均值。

2 結(jié)果與分析

1.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末 (CH3OH)；分子式C35H56O8；ESI-MS:m/z627 [M+Na]+；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.92 (1H,dd,J= 16.2,9.0 Hz,H-21),6.68 (1H,s,H-3),6.56 (1H,dd,J= 15.0,9.0 Hz,H-12),6.25 (1H,d,J= 16.2 Hz,H-20),5.87 (1H,br d,J= 9.0 Hz,H-5),5.78 (1H,d,J= 9.0 Hz,H-11),5.18 (1H,J= 15.0,9.0 Hz,H-13),5.15 (1H,dd,J= 9.15 Hz,H-15),3.94 (1H,dd,J= 7.2,16.2 Hz,H-14),3.80 (1H,m,H-17),3.63 (3H,s,2-OCH3),3.30 (1H,d,J= 6.6 Hz H-7),3.27 (1H,m,H-23),3.23 (3H,s,14-OCH3),3.11 (1H,m,H-18),2.42 (1H,m,H-22),2.07 (1H,dd,J= 14.4,12.0 Hz,H-16),2.00 (2H,m,H-9),1.97 (3H,s,H-26),1.83 (3H,s,H-29),1.60 (1H,m,H-24),1.10 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-31),1.07 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-27),1.05 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-32),0.97 (3H,t,J= 7.2 Hz,H-30),0.93 (6H,m,H-25,H-33),0.90 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-28);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:167.2 (C-1),142.5 (C-2),60.6 (2-OCH3),134.4 (C-3),134.0 (C-4),145.1 (C-5),41.1 (C-6),81.2 (C-7),40.5 (C-8),41.4 (C-9),144.4 (C-10),125.6(C-11),133.0 (C-12),126.7 (C-13),85.1 (C-14),56.0 (14-OCH3),77.3 (C-15),38.7 (C-16),73.5 (C-17),47.4 (C-18),204.9 (C-19),130.0 (C-20),151.0 (C-21),42.6 (C-22),80.9 (C-23),32.6 (C-24),19.6 (C-25),14.0 (C-26),19.8 (C-27),22.9 (C-28),19.6 (C-29),11.3 (C-30),9.6 (C-31),17.8 (C-32)。 以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[7,8]報(bào)道一致，故鑒定為Bafilomycin D。

化合物2 黃色粉末(CH3OH);分子式C44H65NO13；ESI-MS:m/z838 [M+Na]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:7.20 (1H,m,H-2′),6.89 (1H,d,J= 15.0 Hz,H-3′),6.67 (1H,s,H-3),6.49 (1H,dd,J= 15.0,10.8 Hz,H-12),5.81 (1H,d,J= 10.8 Hz,H-11),5.77 (1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),5.16 (1H,dd,J= 15.0,9.6 Hz,H-13),4.95 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-15),4.12 (1H,d,J= 10.8 Hz,H-17),3.88 (1H,t,J= 9.6 Hz,H-14),3.63 (3H,s,2-OCH3),3.61 (1H,m,H-21),3.29 (1H,d,J= 6.6 Hz,H-23),3.24 (3H,s,14-OCH3),2.61 (2H,m,H-8′),2.52 (1H,m,H-6),2.13 (1H,m,H-16),1.99 (3H,s,H-26),1.93 (3H,s,H-29),1.90 (2H,m,H-8),1.76 (1H,m,H-18),1.62 (1H,m,H-24),1.27 (1H,m,H-22),1.20 (2H,m,H-20),1.06 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-27),1.05 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-32),1.02 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-31),0.92 (3H,d,J= 6.6 Hz,H-28),0.78 (6H,m,H-25,H-33),0.83 (3H,d,J= 6.6 Hz,H-30);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:167.3 (C-1),141.2 (C-2),59.9 (2-OCH3),133.6 (C-3),133.3 (C-4),143.0 (C-5),37.1 (C-6),81.1 (C-7),40.0 (C-8),42.0 (C-9),142.8 (C-10),125.2 (C-11),133.4 (C-12),127.1 (C-13),82.2 (C-14),55.5 (14-OCH3),76.8 (C-15),36.6 (C-16),70.6 (C-17),41.2 (C-18),98.8 (C-19),39.9 (C-20),75.4 (C-21),38.1 (C-22),75.4 (C-23),27.8 (C-24),21.0 (C-25),14.0 (C-26),17.2 (C-27),21.6 (C-28),20.1 (C-29),9.8 (C-30),7.0 (C-31),12.2 (C-32),14.2 (C-33),164.2 (C-1′),133.1 (C-2′),133.2 (C-3′),163.7 (C-4′),114.9 (C-5′),175.6 (C-6′),26.2 (C-7′),32.6 (C-8′),198.1 (C-9′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，故鑒定為Bafilomycin B1。

化合物3 黃色粉末(CH3OH)；分子式C45H67NO13；ESI-MS:m/z852 [M+Na]+;1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:7.20 (1H,m,H-2′),6.89 (1H,d,J= 15.0 Hz,H-3′),6.63 (1H,s,H-3),6.48 (1H,dd,J= 15.0,10.8 Hz,H-12),5.81 (1H,d,J= 10.2 Hz,H-11),5.74 (1H,d,J= 9.0 Hz,H-5),5.18 (1H,dd,J= 15.0,9.6 Hz,H-13),5.07 (2H,m,H-15),3.88 (1H,t,J= 9.0 Hz,H-14),3.63 (3H,s,2-OCH3),3.60 (3H,s,19-OCH3),3.69 (3H,s,H-21),3.46 (1H,m,H-23),3.23 (3H,s,14-OCH3),2.61 (4H,m,H-8′),2.52 (1H,m,H-6),2.28 (1H,dd,J= 13.2,4.8 Hz),2.16 (1H,m,H-16),1.98 (3H,s,H-26),1.94 (3H,m,H-29),1.92 (2H,m,H-8),1.68 -1.60 (1H,m,H-18),1.06 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-31),1.05 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-32)1.04 (3H,d,J= 7.2 Hz,H-27),0.93 (3H,d,J= 6.0 Hz,H-28),0.83 (6H,H-25,H-33),0.78 (3H,d,J= 6.6 Hz,H-30);13C NMR (150 MHz,CDCl3)δ:166.6 (C-1),141.4 (C-2),60.2 (2-OCH3),133.4 (C-3),133.1 (C-4),142.7 (C-5),37.5 (C-6),81.2 (C-7),38.7 (C-8),41.2 (C-9),142.2 (C-10),125.3 (C-11),133.0 (C-12),127.4 (C-13),82.7 (C-14),55.5 (14-OCH3),76.8 (C-15),35.3 (C-16),69.4 (C-17),39.8 (C-18),102.8 (C-19),46.4 (19-OCH3),38.4 (C-20),75.1 (C-21),36.6 (C-22),76.9 (C-23),28.2 (C-24),21.7 (C-25),14.0 (C-26),17.3 (C-27),20.5 (C-28),20.0 (C-29),10.7 (C-30),7.4 (C-31),12.3 (C-32),14.1 (C-33),164.3 (C-1′),132.8 (C-2′),132.6 (C-3′),163.7 (C-4′),114.9 (C-5′),175.6 (C-6′),26.2 (C-7′),32.6 (C-8′),198.1 (C-9′)。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10,11]報(bào)道一致，故鑒定為Bafilomycin B2。

1.2 化合物抑菌活性結(jié)果

通過對9株病原菌株的測試，發(fā)現(xiàn)化合物1對所測試病原菌均無活性，化合物2和3對多種植物病原菌具有抑制活性，包括玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、水稻紋枯病菌、玉米彎孢病菌和小麥赤霉病菌。相較于制霉菌素，化合物3對大豆根腐病菌的抑制活性略強(qiáng)(見表1)。

表1 化合物1～3抑菌圈直徑(mm)

注：表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。

Note:Data given were from 3 duplicates.

3 討論

本文從鏈霉菌 KIB-H1556 菌株發(fā)酵液中分離得到3個(gè)化合物。其中Bafilomycin D通過抑制種子的萌發(fā)和生長而表現(xiàn)出除草活性[12]，Bafilomycin B1和Bafilomycin B2等類化合物對液泡(V型)H+-ATPase具有抑制作用[13]。Bafilomycins類化合物是從鏈霉菌中分離得到的16元二烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素，由于其具有生物活性，且含有不同的特征側(cè)鏈，這種獨(dú)特的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)已被廣泛研究[14,15]。然而，在尋找新抗生素的同時(shí)，針對新的靶標(biāo)，測試已知生物活性的代謝物對新靶標(biāo)的生物活性，也顯示出有希望的結(jié)果[16]。因此，對這些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行多種病原體的活性測試，可以揭示其具有新的生物活性及潛在用途。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)化合物2和3具有廣譜抗真菌活性，尤其對玉米病原真菌的抑制活性顯著，為進(jìn)一步研究開發(fā)抑制植物病害的生物農(nóng)藥奠定一定的前期基礎(chǔ)。