羅 婷，王佳琪，江宇勤，范順明，張春玲，余凌英

成都中醫(yī)藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室，成都 611137

黃柏為蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮，習稱川黃柏[1]。其主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類[2]。黃柏炭炮制品，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡的功效，但黃柏炭清濕熱之中兼有澀性，多用于便血，崩漏下血，在全國炮制規(guī)范和各地炮制規(guī)范均有收載[3-5]。2015年版《中國藥典》以小檗堿，黃柏堿作為黃柏質(zhì)量控制標準，尚不能反映黃柏炭的質(zhì)量，且黃柏制炭后各類成分含量均有所變化，巴馬汀成分幾乎消失殆盡，含量最高的小檗堿部分轉(zhuǎn)化為分解產(chǎn)物小檗紅堿[6]。木蘭花堿和小檗紅堿是黃柏炭中的重要成分，應同時作為質(zhì)量控制指標才更具有合理性。本實驗以小檗堿為內(nèi)參物，得出黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿與小檗堿的相對校正因子，建立快捷、方便、全面、實用的一測多評法[7-10]，并對不同產(chǎn)地飲片進行質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標準修訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030C島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；Sartorius BS110S 十萬分之一分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-300E 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

黃柏堿對照品(批號wkq18051608，四川省維克奇生物科技有限公司)；木蘭花堿(批號wkq16050801，四川省維克奇生物科技有限公司)；小檗堿對照品(批號110713-201613，中國食品藥品檢定研究院)；小檗紅堿(批號wkq16061402，四川省維克奇生物科技有限公司)均為純度達到98%以上，可供含量測定用；其他試劑均為分析純。實驗用的30批黃柏炭樣品信息表見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為SHIMADZU InertSustain-C18(4.6 × 250 mm，5 μm)；乙腈(A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(B)溶液為流動相，進行梯度洗脫：0～15 min，10%～14%A；15～35 min，14%～32%A；35～50 min，32%～40%A。進樣體積為5 μL，檢測波長為230 nm，柱溫為35 ℃；流速0.8 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿適量，分別制成濃度為23.5、30.5、102.4、125.6 μg/mL的對照品溶液，混合對照品及飲片樣品圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液(A)和樣品HPLC圖譜(B)Fig.1 HPLC of reference substances (A) and samples (B)注：1黃柏堿；2木蘭花堿；3小檗紅堿；4小檗堿。Note:1 phellodendrine;2 magnolia;3 berberubine;4 berberine.

2.3 供試品溶液的制備

取黃柏炭樣品粉末(過四號篩)約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”下的混合對照品溶液0.5、0.8、1、2、5、10 mL置10 mL容量瓶中定容，制得6種不同濃度的混合對照品溶液。按照“2.1”下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，濃度為橫坐標做回歸曲線方程，各成分在相應的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表2。

2.5 精密度實驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液各5 μL，分別重復進樣6次，測定4種對照品各自的峰面積，結(jié)果黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿峰面積RSD值分別為1.21%、0.54%、0.98%、1.18%表明儀器精密度良好。

表2 4種黃柏炭生物堿成分的線性關(guān)系考察

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液(S1)，分別于0、3、6、12、24、48 h進樣5μL，測定并記錄峰面積。結(jié)果黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿RSD分別為1.72%、1.86%、1.09%、1.53%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性實驗

取同一批樣品6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣5 μL，在“2.3”色譜條件下進行測定并記錄峰面積。計算得到黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿的RSD分別為0.58%、1.61%、1.09%、0.84%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

取6份已知含量的樣品0.2 g，精密稱定，按加入的樣品中黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿的含量比對照品含量比例為1∶1，分別精密加入對照品溶液。按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分析，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果表明黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿、小檗堿平均加樣回收率分別為98.3%、100.5%、99.8%、102%，RSD分別為2.04%、1.58%、2.12%、1.28%，說明該方法準確度良好(見表3)。

表3 加樣回收率計算結(jié)果(n=6)

3 相對校正因子計算及耐用性考察

3.1 相對校正因子計算

取混合對照品溶液分別進樣2、4、6、8、10、20 μL，按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)[11]，式中Ak為內(nèi)標物峰面積，Wk為內(nèi)標物質(zhì)量或濃度，Am為其他組分m的峰面積，Wm為其他組分的質(zhì)量或濃度。以小檗堿為內(nèi)參物，計算黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿的校正因子。結(jié)果見表4。

表4 黃柏炭3種生物堿成分相對校正因子

3.2 待測組份色譜峰定位

利用4個成分色譜行為的不同，以小檗堿為基準峰，計算各個成分的相對保留值、保留時間差，確定其在色譜圖中的位置。結(jié)果見表5。

由表5可知，相對保留值RSD ≤ 5%，保留時間差差異較小。通過相對保留值可準確判斷目標峰的準確峰位置。

表5 黃柏炭3種生物堿成分相對保留值和保留時間差

3.3 考察不同色譜柱及高效液相色譜儀對校正因子和相對保留時間的影響

在兩種不同的儀器上考察了3個品牌色譜柱對校正因子的影響， 結(jié)果表明：不同品牌色譜柱對校正因子和相對保留時間無明顯影響，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器和色譜柱對相對校正因子的影響

續(xù)表6(Continued Tab.6)

儀器Instrument色譜柱Chromatographic column相對校正因子Relative correction factor相對保留值Relative retention valuef(小檗堿/黃柏堿)f(Berberine/Phellodendrine)f(小檗堿/木蘭花堿)f(Berberine/Magnolia)f(小檗堿/小檗紅堿)f(Berberine/Berberubine)T(小檗堿/黃柏堿)T(Berberine/Phellodendrine)T(小檗堿/木蘭花堿)T(Berberine/Magnolia)T(小檗堿/小檗紅堿)T(Berberine/Berberubine)Angilent1260InertSustain0.336 00.311 00.978 30.489 00.506 40.931 2Global Chromatagraphy0.348 90.307 90.965 90.516 50.511 40.908 3Kromasil0.328 10.309 81.010 90.469 30.508 40.942 2平均值Average0.336 60.310 50.986 60.488 70.509 40.940 9RSD%2.271.072.773.671.563.06

3.4 考察不同柱溫、波長、流速對校正因子的影響

在同一色譜條件下，考察25、30、35 ℃三個柱溫、215、230、245 nm 三個波長、考察0.6、0.8、1 mL/min三個體積流量對校正因子的影響，由表5可知柱溫、波長、流速的變化對相對校正因子的影響不大。結(jié)果見表7。

表7 不同柱溫對相對校正因子的影響

4 不同產(chǎn)地黃柏炭測定結(jié)果

按供“2.3”項下方法制備樣品，分別精密吸取供試品溶液各5 μL注入高效液相色譜儀測定。采用外標法和一測多評法分別測定含量，結(jié)果見表8。

測定結(jié)果表明，外標法與一測多評法測得的含量無明顯差異，說明該方法測定結(jié)果具有較高可信度。不同產(chǎn)地黃柏經(jīng)炭制后4種生物堿成分含量具有明顯的區(qū)別，其中滎經(jīng)縣的黃柏炭炮制品成分含量相對較高。

5 結(jié)論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃柏經(jīng)炒炭后有21種化學成分在炮制前后具有明顯的差異[12]。因此單一成分作為質(zhì)量控制指標不夠全面。黃柏在炒炭過程中，隨著炮制時間延長，小檗堿質(zhì)量分數(shù)逐漸減少，而小檗紅堿質(zhì)量分數(shù)逐漸增加，據(jù)此推測，小檗堿在加熱過程中可脫去一個甲基轉(zhuǎn)變?yōu)樾￠藜t堿[13]，且小檗紅堿在4種生物堿含量中僅次于小檗堿，因此增加其作為一測多評法測定指標之一。本實驗引入一測多評法，實現(xiàn)黃柏炭4種生物堿成分的同時測定，對現(xiàn)有質(zhì)量控制方法進行提升，使其更快捷、方便、全面。

表8 不同地區(qū)黃柏炭4種生物堿測定結(jié)果

本實驗考察了不同柱溫、流速、色譜柱、液相色譜系統(tǒng)對小檗堿與黃柏堿、木蘭花堿、小檗紅堿之間相對校正因子的影響，驗證一測多評法在黃柏炭質(zhì)量控制中的可行性和適應性。在不同流速的考察過程中，3種流速對于混合對照品均無明顯影響，但是黃柏炭樣品中成分較多，不同的流速對黃柏炭樣品具有較大影響。在對比了3種流速下黃柏炭樣品峰的基線、分離度、對稱因子等因素后，最后選擇采用流速0.8 mL/min作為本實驗中HPLC流速。

本實驗選擇的30批黃柏均來源于四川。四川作為黃柏的主要產(chǎn)區(qū)，在中國國內(nèi)的生產(chǎn)和銷售都占有舉足輕重的地位。30批黃柏炭中，以滎經(jīng)縣的黃柏炭炮制程度最好，各成分含量也相對較高。黃柏炒炭后，外觀性狀和內(nèi)在成分變化明顯，且所購黃柏炭飲片也因此難以做到炒炭程度統(tǒng)一，因此對于炮制工藝參數(shù)的研究也極為重要。本實驗通過對各主要有效成分的精確定量測定，為黃柏炭質(zhì)量的控制和評價提供更好技術(shù)參考，同時為本課題接下來進一步研究黃柏炭的炮制工藝參數(shù)奠定基礎。