李帥濤，張立超，剌曉琴，李愛平，武海麗，李卓玉,2,*

1山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院；3山西大學(xué)生物技術(shù)研究所；4山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 030006

谷子(Setariaitalica)，學(xué)名栗，是我國傳統(tǒng)優(yōu)勢作物，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和微量元素，具有很高的營養(yǎng)價值，在我國廣泛種植[1]。而谷糠作為谷子加工過程中的副產(chǎn)品，往往被人們所忽視，有研究表明谷糠含有豐富的植物化學(xué)物質(zhì)，如多酚等，具有廣泛的生物學(xué)特性和藥理反應(yīng)[2]。有研究表明植物多酚具有抗氧化、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等，從而抑制癌細(xì)胞的增殖[3]。

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一，主要由乳腺導(dǎo)管上皮出現(xiàn)惡性改變而發(fā)生[4]。近年來，乳腺癌發(fā)病率不斷增加，已經(jīng)嚴(yán)重威脅了我國女性的身心健康[5]。乳腺癌的發(fā)生有許多內(nèi)源和外源的因素參與其中，是一個長期的、多因素的過程[6]。目前，手術(shù)及放化療仍是治療乳腺癌的主要方式，但治療過程往往帶來嚴(yán)重的副作用[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BPIS對人肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞以及結(jié)直腸癌細(xì)胞等多種癌癥細(xì)胞均有顯著的抑制作用[8]，尤其能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的活性，但對正常乳腺細(xì)胞沒有明顯影響，因此探明其具體作用機(jī)制將擴(kuò)展臨床治療手段，減輕副作用，對乳腺癌的治療具有重要意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠通過計算機(jī)模擬算法、運(yùn)用組學(xué)、高通量篩選及網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)揭露藥物-靶點-疾病之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號關(guān)系，已經(jīng)成為揭示生物系統(tǒng)復(fù)雜功能和行為的有力工具[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)角度對藥物的作用機(jī)制進(jìn)行整體分析，具有高通量、快速、靈敏和準(zhǔn)確的特點[10]。因此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對BPIS抗乳腺癌作用的靶點與通路進(jìn)行篩選，構(gòu)建BPIS的成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)模型，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度對BPIS抗乳腺癌的可能作用機(jī)制進(jìn)行整體闡釋，為后續(xù)具體作用機(jī)制的研究以及特殊醫(yī)藥食品的開發(fā)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

谷子品種為晉谷21號，產(chǎn)地為山西省晉中市，由山西省天下谷公司提供。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(南京恩晶生物科技有限公司)；人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和正常乳腺細(xì)胞MCF-10A(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；RPMI-1640 Medium培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基和DMEM High Glucose培養(yǎng)基(山西百奧生物技術(shù)有限公司)；青鏈霉素(100X，北京索萊寶科技公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶(北方同正公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Eppendorf Galaxy 170S)；倒置顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 BPIS對乳腺癌細(xì)胞活性檢測

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231和人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。等到細(xì)胞長滿貼壁，用胰酶消化、1 000 rpm離心制成細(xì)胞懸液，接種到12孔板中，細(xì)胞濃度為1×105/孔。細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基，加入1 mL含BPIS的新培養(yǎng)基，BPIS濃度為2、4、8 μg/mL。加藥處理24 h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。

1.3 BPIS活性成分的鑒定

稱取一定量的谷糠，用80%的預(yù)冷丙酮室溫攪拌2 h(谷糠，丙酮物料比為1∶20)，靜置20 min后棄上清，用NaOH(2 mol/L)于室溫下攪拌1 h(物料比1∶10)。加適量HCl終止消化，調(diào)節(jié)PH為7。11 000 rpm，離心5 min，取上清。上清中加入乙酸乙酯(乙酸乙酯∶上清=1∶1)進(jìn)行脫脂，靜置10 min，11 000 rpm，離心10 min，取上清，重復(fù)操作5次。將得到的多酚于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的液體用100D透析袋透析除鹽，真空冷凍干燥，即可得到谷糠結(jié)合態(tài)多酚。

本課題組在前期實驗中采用大孔樹脂柱對BPIS成分進(jìn)行分離純化，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積、真空凍干至粉末，用甲醇配置成溶液，通過超高效液相色譜-高分辨飛行質(zhì)譜連用儀(UPLC-Triple-TOF/MS)對BPIS中主要成分進(jìn)行了鑒定[11]。

1.4 BPIS作用靶點預(yù)測

將整理得到的BPIS活性成分，導(dǎo)入PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中，得到Smiles化學(xué)式并下載其3D分子結(jié)構(gòu)式，保存為SDFile(.sdf)格式。將BPIS活性成分對應(yīng)的Smile化學(xué)式輸入到SEA (http://sea.bkslab.org/) 數(shù)據(jù)庫中，得到作用靶點。DRAR-CPI(https://cpi.bio-x.cn/drar/)是一種反向分子對接服務(wù)器，服務(wù)器以對接得分(Z′-score)表示活性成分與蛋白質(zhì)間相互作用強(qiáng)度，規(guī)定Z′-score<-0.5時活性成分與靶點有結(jié)合的可能性[12]。登陸DRAR-CPI服務(wù)器，上傳BPIS活性成分的.sdf格式文件，為了提高預(yù)測準(zhǔn)確度，選取Z′-score<-1的靶點作為藥物潛在靶點。將篩選到的靶點PDB ID導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫，轉(zhuǎn)化為GeneCards數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的基因名稱(Gene name)。為了提高靶點的準(zhǔn)確性，對兩個數(shù)據(jù)庫得到的作用靶點進(jìn)行整理，作為BPIS潛在的作用靶點。

1.5 乳腺癌相關(guān)靶點預(yù)測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和HOME-NCBI-GENE (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)數(shù)據(jù)庫，輸入關(guān)鍵詞“Breast cancer”，設(shè)置物種為人，進(jìn)行檢索，得到與乳腺癌相關(guān)的潛在靶點。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將預(yù)測得到的BPIS 潛在作用靶點與乳腺癌相關(guān)靶點進(jìn)行匹配，得到BPIS抗乳腺癌的潛在作用靶點。將靶點信息導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[13]，設(shè)置物種為人，獲取蛋白相互作用關(guān)系，將結(jié)果保存為TSV格式文件。從文件中獲取node1、node2和Combined score相關(guān)信息，并導(dǎo)入Cytoscape version軟件，制作蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行分析。將節(jié)點大小和顏色與degree的大小關(guān)聯(lián)，將邊的粗細(xì)與combine score的大小關(guān)聯(lián)，建立靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.7 活性成分-蛋白靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將BPIS活性成分和抗乳腺癌潛在靶點導(dǎo)入Cytoscape version軟件，構(gòu)建BPIS活性成分-抗乳腺癌靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.8 GO和KEGG富集分析

將BPIS抗乳腺癌潛在靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david. ncifcrf.gov/)，將列表和背景物種限定為人，進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析。本研究選擇GO分析中生物過程(BP，biological process)、分子功能(MF，molecular function)和細(xì)胞成分(CC，cell component)3個模塊對基因功能進(jìn)行注釋，并設(shè)置閾值P<0.05，按照靶點數(shù)目篩選排名靠前的生物功能和通路，并進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 BPIS對乳腺癌細(xì)胞活性有明顯抑制作用

利用濃度梯度的BPIS處理乳腺癌細(xì)胞24 h，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著的改變，如圖1所示，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞由原來的長梭形逐漸變圓，并且皺縮，發(fā)生明顯的死亡現(xiàn)象，而對照組MCF-10A形態(tài)無明顯變化。隨后，利用血球計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并統(tǒng)計其存活率，結(jié)果如圖2所示，MCF-10A與對照組相比無明顯變化，而MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)濃度為8 μg/mL的BPIS處理24 h，細(xì)胞存活率顯著降低，表明BPIS對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的生長有顯著抑制作用，而對正常乳腺細(xì)胞作用不明顯。

2.2 BPIS活性成分及靶點預(yù)測

通過前期對BPIS組分的鑒定，并以鑒定出的活性成分和癌癥為關(guān)鍵詞在PubMed進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，去除檢索結(jié)果為0的活性成分，整理得到8個BPIS化學(xué)成分，詳見表1。將BPIS活性成分導(dǎo)入SEA數(shù)據(jù)庫和DRAR-CPI服務(wù)器，并選取Z′-score<-1，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，整理得到577個作用靶點。對GeneCards數(shù)據(jù)庫和HOME-NCBI-GENE數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果進(jìn)行整理，得到乳腺癌相關(guān)靶點1676個。將BPIS作用靶點與乳腺癌靶點進(jìn)行匹配，整理得到39個BPIS抗乳腺癌潛在靶點，詳見表2。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將篩選得到的39個潛在靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”檢索得到蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果保存為TSV格式文件，將文件中node1、node2和Combined score相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape version軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，詳見圖3。

圖中節(jié)點(node)代表作用靶點，節(jié)點的大小代表該靶點作用強(qiáng)度，靶點的degree等級越高，節(jié)點越大，對應(yīng)的顏色由綠到紅逐漸加深。其中邊(edge)表示靶點之間的關(guān)聯(lián)，邊的粗細(xì)代表靶點間關(guān)聯(lián)的大小，靶點間Combine score 值越大，靶點間結(jié)合度越高，邊越粗。圖中共有39個節(jié)點，286條邊，平均節(jié)點度為14.7，平均局部聚類系數(shù)為0.694。其中靶點RHOA與MAPK8、靶點EGFR與CCND1和靶點PTGS 2與VEGFA相連的邊較粗，說明結(jié)合程度較大。同時，靶點INS、ESR1、HRAS和MAPK1的節(jié)點較大，說明 degree等級較大，預(yù)測以上靶點可能發(fā)揮主要作用。胰島素(INS)是由β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性刺激，而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，能夠促進(jìn)糖原、脂肪和蛋白質(zhì)的合成，最新醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)顯示，糖尿病及糖脂代謝障礙與許多惡性腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)[14]。HRAS屬于RAS家族的小GTP酶，是癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變的致癌基因，HRAS調(diào)節(jié)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，包括RAF-MEK-ERK級聯(lián)、VEGF-PI3K-AKT途徑和Raf-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成和自噬等發(fā)生[15]。MAPK1是一類絲裂原活化蛋白激酶，據(jù)研究報道，MAPK1參與了細(xì)胞的自噬、脂代謝、增殖、遷移和侵襲等過程[16,17]。可以預(yù)測BPIS主要通過對細(xì)胞的增殖、遷移、自噬和糖脂代謝的調(diào)控來發(fā)揮抗乳腺癌作用。

圖2 BPIS對乳腺癌細(xì)胞活性的影響(n=3, x±s)Fig.2 Effect of BPIS on the activity of breast cancer cells (n=3, x±s)注：*P<0.05，**P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01.

表1 BPIS中活性成分

表2 BPIS活性成分抗乳腺癌潛在靶點

續(xù)表3

序號No.基因名稱Gene nameUniProt ID蛋白名稱Protein name程度Degree介數(shù)Betweeness7ABCB1P08183多藥耐藥蛋白1Multidrug resistance protein 150.067 812 618PTGS2P35354前列腺素G / H合成酶2Prostaglandin G/H synthase 230.001 852 249GSTM1P09488谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶Mu 1Glutathione S-transferase Mu 140.006 722 4510SERPINE1P05121纖溶酶原激活物抑制劑-1Plasminogen activator inhibitor 120.008 759 8611MAPK1P28482絲裂原激活蛋白激酶1Mitogen-activated protein kinase 11012GSTT1P30711谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶T1Glutathione S-transferase theta-160.043 502 8213GSTP1P09211谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶Glutathione S-transferase P30.003 121 2214CD44P16070CD44抗原CD44 antigen1015ESR2Q92731雌激素受體βEstrogen receptor beta30.000 815 2516RELAQ04206轉(zhuǎn)錄因子p65Transcription factor p6530.001 852 2417GSK3BP49841糖原合成酶激酶-3Glycogen synthase kinase-3 beta1018CYP1A1P04798細(xì)胞色素P450 1ACytochrome P450 1A130.031 687 8519PARP1P09874聚[adp -核糖]聚合酶1Poly [ADP-ribose] polymerase 11020MMP1P03956間質(zhì)膠原酶Interstitial collagenase30.000 815 2521RHOAP61586轉(zhuǎn)化蛋白RhoATransforming protein RhoA60.013 908 0722PTK2Q05397局灶性粘附激酶1Focal adhesion kinase 11023MAPK8P45983絲裂原激活蛋白激酶8Mitogen-activated protein kinase 81024IGFBP3P17936胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3Insulin-like growth factor-binding protein 330.002 434 225HDAC1Q13547組蛋白脫乙酰酶1Histone deacetylase 140.003 614 4826FGFR1P11362成纖維細(xì)胞生長因子受體1Fibroblast growth factor receptor 11027CYP1B1Q16678細(xì)胞色素P450 1B1Cytochrome P450 1B150.067 845 628PLAUP00749尿激酶型纖溶酶原激活劑Urokinase-type plasminogen activator1029HRASP01112GTP酶HRasGTPase HRas20.008 759 8630MGMTP16455甲基鳥嘌-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase70.054 731 7531ERBB3P21860酪氨酸激酶erbB-3Receptor tyrosine-protein kinase erbB-31032EP300Q09472組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300Histone acetyltransferase p30040.003 614 48

續(xù)表3

序號No.基因名稱Gene nameUniProt ID蛋白名稱Protein name程度Degree介數(shù)Betweeness33SHBGP04278性激素結(jié)合球蛋白Sex hormone-binding globulin20.000 846 4134ABCC1P33527多藥耐藥相關(guān)蛋白1Multidrug resistance-associated protein 120.018 645 0535INSP01308胰島素Insulin1036CDK2P24941細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2Cyclin-dependent kinase 21037IL2P60568白細(xì)胞介素-2Interleukin-220.008 759 8638RARBP10826維甲酸受體Retinoic acid receptor beta60.013 908 0739CCNB1P14635G2 /有絲分裂特異性細(xì)胞周期蛋白B1G2/mitotic-specific cyclin-B110

圖3 BPIS蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein interaction network of BPIS．注：節(jié)點的顏色和大小代表作用強(qiáng)度，邊的粗細(xì)代表結(jié)合度。Note: The size and the color of the node represents the value of the degree, the thickness of the side indicates the value of the combine score.

2.4 BPIS活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將BPIS活性成分和作用靶點相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape version軟件，構(gòu)建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖4。圖中共有47個節(jié)點，107條邊，其中菱形綠色的節(jié)點代表BPIS活性成分，圓形紅色的節(jié)點代表相關(guān)靶點。由圖中可以看出，活性成分Vitexin對應(yīng)22個靶點，靶點MGMT對應(yīng)了7個活性成分，體現(xiàn)了BPIS多成分、多靶點的調(diào)節(jié)特點。

圖4 BPIS活性成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Components-targets network of BPIS 注：綠色棱形代表BPIS主要活性成分，紅色圓形代表BPIS抗乳腺癌潛在靶點。Note: The green diamond is the main active components of BPIS，the red circle is the potential anti-breast cancer targets of BPIS.

2.5 GO和KEGG富集分析

將BPIS活性成分對應(yīng)的靶點信息導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析。根據(jù)分析結(jié)果設(shè)置閾值P<0.05，篩選得到12個生物過程，如圖5所示，分別為RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、藥物反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、GTP酶活性激活正調(diào)控、血管生成、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、蛋白磷酸化、細(xì)胞凋亡正調(diào)控、PI3K信號傳導(dǎo)正調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)正調(diào)節(jié)及細(xì)胞多脂多糖反應(yīng)。細(xì)胞成分的分析結(jié)果如圖6所示，靶點主要涉及核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和胞液等。靶點涉及的分子功能如圖7所示，主要有蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、酶結(jié)合及蛋白激酶活性等。其中蛋白激酶是催化蛋白質(zhì)磷酸化過程的酶，在腫瘤細(xì)胞中有重要的作用。蛋白激酶Mst是在體內(nèi)普遍表達(dá)的一種蘇氨酸蛋白激酶，研究發(fā)現(xiàn)激活Mst活性可以引起細(xì)胞凋亡[18]。

圖5 GO生物過程富集分析Fig.5 Gene Ontology (GO) analysis of Biological process

圖6 GO細(xì)胞成分富集分析Fig.6 Gene Ontology (GO) analysis of cell component

圖7 GO分子功能富集分析Fig.7 Gene Ontology (GO) analysis of molecular function

KEGG通路富集分析(圖8)發(fā)現(xiàn)，這些靶點主要涉及癌癥信號通路(pathways in cancer)、蛋白多糖在癌癥中的作用(proteoglycans in cancer)、PI3K-AKT信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)和ErbB信號通路等。粘蛋白(MUC1)是一種與腫瘤相關(guān)的糖蛋白，在90%的乳腺癌中高表達(dá)，且與乳腺癌患者的瘤負(fù)荷量成正比，以MUC1為乳腺癌治療的靶點可以有效的殺傷乳腺癌[19]。PI3K/AKT(絲氨酸/蘇氨酸激酶)信號通路可以通過促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移和增殖、減少凋亡等途徑促進(jìn)乳腺癌腫瘤的形成，有研究表明使用小檗堿可以通過抑制AKT-mTOR信號通路，從而誘導(dǎo)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞自噬及凋亡[20]。以上結(jié)果與文獻(xiàn)基本一致，表明了BPIS活性成分的相關(guān)靶點分布在不同的代謝通路，體現(xiàn)了BPIS多成分、多靶點協(xié)同抗乳腺癌的作用機(jī)制。

圖8 BPIS相關(guān)靶點的KEGG代謝通路富集分析Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis of BPIS potential targets

2.6 靶點通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對BPIS相關(guān)靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，并整合繪制出最終的通路圖。如圖9所示，將BPIS抗乳腺癌相關(guān)靶點標(biāo)記為淺綠色，通路靶點標(biāo)記為淺藍(lán)色。圖中顯示了EGFR/MAPK、EGFR/Ras、RhoA、INS/PI3K-AKT、CD44和VEGF信號通路可能參與了BPIS對乳腺癌細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)。EGFR是一種具有內(nèi)在蛋白酪氨酸激酶活性的跨膜受體蛋白，其活化會導(dǎo)致廣泛的生物反應(yīng)，涉及細(xì)胞的凋亡、遷移和增殖等，而三陰性乳腺癌的特征在于EGFR的過表達(dá)和其下游信號傳導(dǎo)途徑的激活；有研究發(fā)現(xiàn)使用單克隆抗體西妥昔和一種酪氨酸酶激酶抑制劑對EGFR進(jìn)行雙重靶向治療，能夠?qū)APK和RAS信號通路進(jìn)行抑制，可能成為三陰性乳腺癌的潛在治療方法[21,22]。PI3K/AKT信號通路在乳腺癌中往往是被激活的，且有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，能夠通過促進(jìn)分子伴侶介導(dǎo)的自噬，從而抑制細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[23,24]。CD44是哺乳動物細(xì)胞表面上普遍存在的糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其在多種實體腫瘤如：乳腺癌、肺癌和胰腺癌中高度表達(dá)[25]。實體瘤的進(jìn)展取決于惡性組織中血管的形成，在一系列促血管生成因子中，血管內(nèi)皮生長因子VEGF起著關(guān)鍵作用，VEGF的阻斷可導(dǎo)致血管網(wǎng)絡(luò)的消退并抑制腫瘤的生長[26]。其中EGFR/MAPK和INS/PI3K-AKT都與糖脂代謝的調(diào)節(jié)有密切聯(lián)系，同時分析結(jié)果顯示，與上述信號通路聯(lián)系最密切的死亡相關(guān)過程只有自噬，表明BPIS很可能通過調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中的糖脂代謝促進(jìn)其自噬性死亡，從而發(fā)揮特異性的抗乳腺癌作用。

圖9 BPIS抗乳腺癌潛在靶點通路分析Fig.9 Potential anti-breast cancer pathways of BPIS

3 結(jié)論

谷糠雖然是谷物加工過程中的副產(chǎn)品，但它含有豐富的營養(yǎng)元素和活性物質(zhì)，其中谷糠結(jié)合態(tài)多酚具有較高的生物活性，包括抗氧化、抗高血糖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[27]。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，三陰性乳腺癌是較特殊的類型，具有惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)等特點，目前缺乏有效的治療手段[28]。我們研究發(fā)現(xiàn)，BPIS對乳腺癌細(xì)胞具有特異性殺傷作用。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對BPIS發(fā)揮抗乳腺癌作用的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的分析和預(yù)測，為進(jìn)一步深入研究BPIS抗乳腺癌作用提供了扎實的理論依據(jù)。

富集分析結(jié)果顯示，BPIS主要參與調(diào)控藥物反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、蛋白磷酸化等生物過程；涉及核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和胞液等細(xì)胞組分；涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶活性等分子功能。靶點通路富集分析結(jié)果顯示：12個靶點參與PI3K-AKT信號通路(30.8%)、9個靶點參與FoxO信號通路(23.1%)、9個靶點參與Ras信號通路(23.1%)、7個靶點參與ErbB信號通路(17.9%)，其中FoxO信號、MAPK信號、PI3K/AKT信號以及INS信號都與糖脂代謝以及細(xì)胞自噬存在顯著相關(guān)性。

有研究表明胃癌組織中，自噬相關(guān)基因LC3和FoxO表達(dá)水平顯著增高[29]，且FoxO的磷酸化有助于三酰甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MTP的表達(dá)和極低密度脂蛋白VLDL的產(chǎn)生，促進(jìn)脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)[30]。然而p38MAPK、PI3K/AKT和FoxO1的磷酸化水平與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其磷酸化減弱后能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生[31-33]。同時有研究表明脂代謝相關(guān)基因FTO在乳腺癌細(xì)胞中高度表達(dá)，用FTO抑制劑處理后，乳腺癌細(xì)胞中PI3K/AKT表達(dá)水平明顯降低，說明PI3K/AKT信號參與了乳腺癌細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝[34]。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道以及本研究所做的相關(guān)分析，我們推測BPIS可能通過阻斷脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝，使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致PI3K/AKT和FoxO等信號的減弱，從而引發(fā)細(xì)胞自噬，過度的自噬導(dǎo)致正常的細(xì)胞功能受損以及進(jìn)一步的細(xì)胞死亡。由于腫瘤細(xì)胞本身就存在較強(qiáng)的自噬活動，BPIS的進(jìn)一步誘導(dǎo)使其很容易達(dá)到自噬性死亡的最大閾值，這可能也是BPIS對腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用的重要原因。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示BPIS中8個活性成分作用于39個靶點，涉及了多個生物過程、分子功能和細(xì)胞成分。通過對蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和BPIS活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)靶點之間，活性成分和靶點之間存在相互作用關(guān)系，體現(xiàn)了特殊醫(yī)藥食品多成分-多靶點-多途徑的作用特點。這一研究將為深入探討B(tài)PIS抗乳腺癌的作用機(jī)制以及進(jìn)一步的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。