楊鳳軒，李 剛，袁漢文*，夏祥華，夏 勉，周 瓊

1廣西民族大學(xué) 廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530006；2廣西藥用植物園，南寧 530023；3蒼溪縣國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)院士工作站，蒼溪 628400；4廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是我國特有的傳統(tǒng)保健藥材，具有止咳、祛痰、潤肺、降血糖、保肝、抗癌等多種作用[1-3]，是首批被國家衛(wèi)生部公布的藥食兩用中藥材[4]。研究表明，羅漢果中最主要的有效成分為葫蘆烷型四環(huán)三萜皂苷類，以羅漢果甜苷V為主，是一類強(qiáng)甜味的非糖物質(zhì)，其甜度是蔗糖的256～344倍，且其皂苷的苷鍵均為β鍵，人體不能將其分解消化[5]，食用后不會引起機(jī)體的血糖升高，屬于“低卡路里食品”[6,7]。因此，羅漢果不僅有抗霧霾的開發(fā)潛力，還可作為藥品、食品相關(guān)的功能產(chǎn)品為包括糖尿病和肥胖癥患者等在內(nèi)的廣大人群食用，需求量日益增長[8]。

但傳統(tǒng)中，羅漢果主要分布于廣西、湖南等熱帶、亞熱帶地區(qū)[9]。隨著羅漢果在各領(lǐng)域的應(yīng)用不斷拓寬，國內(nèi)外市場需求不斷加大，廣西、湖南、四川等省份地區(qū)的羅漢果種植面積越來越廣，考察控制不同產(chǎn)區(qū)果實(shí)品質(zhì)，直接關(guān)系到羅漢果深加工產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量與發(fā)展[10]。

硒元素是人體必需微量元素之一，在人體內(nèi)具有提高免疫力、防癌抗癌、抑制艾滋病、糖尿病等作用[11]。近年來針對我國廣泛存在的硒的“隱形饑餓”問題，各地硒產(chǎn)業(yè)競相發(fā)展，硒資源的開發(fā)利用迎來前所未有的熱潮，但未曾有不同產(chǎn)區(qū)羅漢果中硒含量相關(guān)的系統(tǒng)研究報(bào)道[12]。

本文擬采用香草醛-濃硫酸分光光度比色法、高效液相色譜法和氫化物原子熒光光譜法對10個不同產(chǎn)地羅漢果總苷、甜苷V和硒進(jìn)行含量測定，為羅漢果的推廣種植、科研和開發(fā)利用等提供參考指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅漢果果實(shí)，取自四川、湖南、廣西等9個地區(qū)(參見表3)，每個樣品地區(qū)隨機(jī)摘取15個成熟“青皮果”樣品，統(tǒng)一經(jīng)50 ℃烘烤至恒重，粉碎，混勻，過50目篩后置密封袋備用。

1.2 試劑與儀器

羅漢果甜苷V對照品，純度≥ 98%(北京索萊寶科技有限公司)；硒標(biāo)準(zhǔn)品：濃度1 000 μg /mL，介質(zhì)為10%鹽酸(國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院)。AB-8型大孔吸附樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；乙腈為色譜級(美國Fisher公司)，硝酸、高氯酸、鹽酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀為優(yōu)級純，其余所用試劑均為分析純，水為超純水。

安捷倫1260高效液相色譜儀；色譜柱Alltima(TM)C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)752 N型紫外可見分光光度計(jì)；AFS-8220原子熒光光度計(jì)：配硒空心陰極燈；CEN微波消解儀：配聚四氟乙烯消解罐；EHD-12電熱消解儀。

1.3 方法

羅漢果總甜苷、甜苷V及硒含量的測量具體方法如下述。首先對各指標(biāo)的測量進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性等方法學(xué)考察。然后，每個指標(biāo)各樣品均設(shè)三次重復(fù)，RSD < 10%。分別采用外標(biāo)法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各指標(biāo)的含量。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理，采用SAS軟件進(jìn)行差異顯著性的方差分析和新復(fù)極差測驗(yàn)。

1.3.1 甜苷V的含量測定

甜苷V含量的測定方法根據(jù)《中國藥典》(2015年版)[13]中羅漢果含量測定的高效液相色譜法。

甜苷V對照品的配制：精密稱取羅漢果甜苷V標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用乙腈-水(22∶78)溶液經(jīng)超聲溶解至刻度線，搖勻，得羅漢果甜苷V標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.233 6 mg/mL)，濾液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。

試樣的制備：每個樣品設(shè)置三個平行，加入甲醇加熱回流兩個小時，續(xù)濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后用水溶解，AB-8大孔吸附樹脂柱洗脫，收集洗脫液蒸干；殘?jiān)D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加流動相定容，過濾，即得。

分別將甜苷V對照品與試樣注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄各峰面積，按外標(biāo)法[13]計(jì)算含量。

1.3.2 總皂苷含量的測定

總皂苷含量的測定方法根據(jù)李鋒等[14]香草醛—濃硫酸試劑分光光度計(jì)比色法。

總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精準(zhǔn)稱取羅漢果對照品5 mg配制成1.0 mg/mL的水溶液。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液100、150、200、250、300 μL，加水稀釋到0.5 mL，再加入10%香草醛乙醇溶液0.5 mL。冰浴下加入75%硫酸5 mL。在恒溫水浴鍋中50 ℃加熱20 min。在冰浴中冷卻10 min，同時做空白試劑。

試樣的配制：羅漢果粉于甲醇中浸泡12 h后加熱回流6 h，上清液水浴蒸干；用水分洗滌并轉(zhuǎn)移至AB-8型大孔樹脂柱洗脫，收集醇液并蒸干；殘?jiān)詿崴芙庥? mL容量瓶中定容，后同標(biāo)準(zhǔn)品，作為供試品溶液。

1.3.3 硒含量的測定

硒含量的測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》[15]食品中硒的測定，氫化物原子熒光光譜法測定。

硒標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精確吸取1 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液加入5%鹽酸溶液配制成濃度10 μg/mL中間液。分別利用100 g/mL鐵氰化鉀與5%鹽酸溶配制出硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，質(zhì)量濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 μg/L。

硒試樣的制備：微波消解法，羅漢果粉分別加入硝酸與過氧化氫，于微波消解儀硝化，后轉(zhuǎn)入電熱消解儀加熱至近干，加6 mol/L鹽酸溶液繼續(xù)加熱至澄清，加入2.5 mL鐵氰化鉀溶液(100 g/mL)，用水定容至10 mL容量瓶中，同時做質(zhì)控和空白試樣。

檢測與條件：以5%鹽酸溶液為載流，硼氫化鉀堿溶液為還原劑(現(xiàn)配現(xiàn)用)，儀器條件為，光電倍增管負(fù)高壓270 V，燈電流80 mA，載氣流量300 mL/min，屏蔽氣流量800 mL/min，原子化器高度8 mm，注入量0.5 mL。

2 結(jié)果與討論

按1.3.1色譜條件，得到指紋圖譜如圖1，樣品色譜圖與對照品色譜圖相應(yīng)的位置上有相同保留時間的色譜峰，由此可確定甜苷V的出峰時間。

羅漢果甜苷V檢測方法學(xué)考察結(jié)果表明，取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD為1.39%(n= 6)，精密度良好；取供試品溶液置于室溫下，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測定甜苷V吸收峰面積，計(jì)算RSD值為2.19%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定；按供試品溶液制備方法將5號樣品制備6個重復(fù)，依法測定，6個樣品峰面積RSD為1.91%。

檢測發(fā)現(xiàn)，以相同方式處理不同產(chǎn)地羅漢果，其色譜圖有一定的相似度，但色譜峰的強(qiáng)度有明顯差異，以各地區(qū)甜苷V的出峰面積為參量，利用SPSS軟件做指紋圖譜的聚類分析，結(jié)果如圖二。不同產(chǎn)地羅漢果甜苷V含量可分為四類，第一類為2、5、6、7號樣品，8、9號樣品為第二類，1、4號樣品為第三類，3號樣品為第四類。說明不同產(chǎn)地相同品種羅漢果甜苷V含量具有一定差異，但與省份之間的關(guān)聯(lián)不明顯。

圖1 羅漢果標(biāo)準(zhǔn)品與不同產(chǎn)地羅漢果樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of Siraitia grosvenorii standard and samples from different habitats注：a：羅漢果甜苷V標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；b：9個產(chǎn)地羅漢果樣品指紋圖譜。Note:a:Chromatography of Siraitia grosvenorii Glycoside V standard;b:Fingerprint of Siraitia grosvenorii samples from 9 habitats.

分別將總皂苷標(biāo)準(zhǔn)系列在600 nm檢測波長的紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行檢測，以吸光值(abs)為橫軸，以羅漢果皂苷量(μL)為縱軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為其中y= 59.683x-5.003 2，R= 0.999 39。

羅漢果總皂苷檢測方法學(xué)考察結(jié)果表明，取同一供試品溶液，重復(fù)檢測6次，RSD為1.26%(n= 6)，精密度良好；取供試品溶液置于室溫下，分別于0、15、30、40、50、60 min進(jìn)樣10 μL，測定吸光度，計(jì)算RSD值為1.87%，表明，供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定；按供試品溶液制備方法將5號樣品制備6個重復(fù)，依法測定，6個樣品吸光值RSD為2.61%，具有較好的重復(fù)性。

圖2 不同產(chǎn)地羅漢果樣品指紋圖譜聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis for fingerprints of Siraitia grosvenorii samples from different habitats

按1.3.2方法測定總皂苷吸光度，將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品總皂苷含量。并進(jìn)行羅漢果樣品中甜苷V、總苷含量的差異顯著性分析、多重比較，以及總苷中甜苷V占比計(jì)算，結(jié)果匯總?cè)绫?。

分別將硒標(biāo)準(zhǔn)系列導(dǎo)入原子熒光光度計(jì)測其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 0.020 12x+ 0.123 65，其中R= 0.999 99。

在相同條件下，將樣品溶液分別按順序?qū)雰x器，質(zhì)控樣品在其范圍之內(nèi)，得出樣品濃度并計(jì)算[15]硒含量，結(jié)果整理并經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后匯總?cè)绫?。

表1 不同產(chǎn)地羅漢果甜苷 V 、總苷含量測定結(jié)果

注：差異顯著水平P<0.05；不同字母表示多重比較的顯著差異。

Note:Significant difference levelP<0.05;Different letters indicate the significance of the difference.

表2 不同產(chǎn)地羅漢果硒含量測定結(jié)果

注：差異顯著水平P<0.05；不同字母表示多重比較的顯著差異。

Note:Significant difference levelP<0.05;Different letters indicate the significance of the difference.

由表1可知，就甜苷V含量而言，湖南湘西回龍路果實(shí)中最高，其次是廣西南寧西鄉(xiāng)塘區(qū)，分別是1.42%和1.41%，湖南湘西龍山縣茅坪鄉(xiāng)的最低，為0.68%；就總皂苷含量而言，湖南懷化市辰溪縣火馬沖產(chǎn)羅漢果果實(shí)中含量最高，為3.34%，湖南湘西龍山縣咱果鄉(xiāng)土車村的最低，含量為2.42%；就總皂苷中甜苷V的占比而言，樣品來源前面三位由高到低依次為：湖南湘西龍山縣民安鎮(zhèn)回龍路、廣西桂林永?？h龍江鄉(xiāng)保安村、廣西桂林市臨桂區(qū)兩江鎮(zhèn)，分別為：56.48%、52.06%和49.34%，占比最低的是湖南湘西龍山縣茅坪鄉(xiāng)的果實(shí)，為28.03%。

近年來，隨著羅漢果的種植、開發(fā)等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，對羅漢果成分的測定和質(zhì)量控制也日益受到重視。劉金磊等[10]分別采用紫外分光光度比色法和高效液相色譜法測定了桂北不同產(chǎn)地、不同品種羅漢果中的總皂苷和甜苷V的含量，總皂苷和甜苷V含量范圍分別為2.45%～3.36%和0.81%～1.94%。周小雷等[16]建立HPLC測定羅漢果藥材中羅漢果甜苷 V含量的方法，對不同品系羅漢果甜苷V的含量進(jìn)行了測定，測得羅漢果甜苷V含量范圍為0.25%～1.44%。本實(shí)驗(yàn)采用香草醛-濃硫酸分光光度比色法和高效液相色譜法對不同產(chǎn)地羅漢果總苷和甜苷V含量進(jìn)行測定，甜苷V和總皂苷含量范圍分別為0.68%～1.42%和2.42%～3.34%，接近前人的研究結(jié)果。廣西、湖南、四川3個省份由南到北，緯度由低到高，但不論是總皂苷和甜苷V的含量，還是甜苷V在總皂苷中的占比，3個省份羅漢果果實(shí)樣品之間沒有表現(xiàn)出隨緯度的差異顯著性的規(guī)律性變化。

基因組和轉(zhuǎn)錄組研究[17-19]表明，大量基因參與羅漢果果實(shí)發(fā)育及品質(zhì)形成，不同時期果實(shí)中分別有不同的中間代謝產(chǎn)物。由前述結(jié)果可知，盡管羅漢果果實(shí)發(fā)育時期一致，但總皂苷及甜苷V的含量不同，由于實(shí)驗(yàn)材料均為遺傳背景相對一致的青皮果，造成這些差異的原因可能在于，不同產(chǎn)區(qū)溫度、光照、肥、水等生長條件的差異導(dǎo)致果實(shí)生長期溫光積累和營養(yǎng)條件不同，由于羅漢果皂苷合成進(jìn)度不一致，因此，對于不同產(chǎn)區(qū)的羅漢果，宜根據(jù)品質(zhì)要求進(jìn)行抽樣分析，以確定適齡的果實(shí)收獲期。

由表2可見，湖南懷化市辰溪縣火馬沖的羅漢果果實(shí)中硒含量最高，其次是廣西南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)的和廣西桂林市臨桂區(qū)兩江鎮(zhèn)的，其硒的含量分別為41.462、32.696、32.373 μg/kg。鄧衛(wèi)利等[20]測定桂林山區(qū)種植的普通羅漢果硒含量為57 μg/kg，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，而其培育的富硒羅漢果硒含量為109 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通羅漢果硒含量。沈麗水等[21]研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)種植中草藥含硒量差異明顯，如高硒區(qū)陜西省紫陽縣產(chǎn)防風(fēng)、益母草、淫毛藿、升麻、白芨五種中草藥平均含硒3.38 mg/kg，而天水產(chǎn)這5種中草藥平均含硒0.52 mg/kg，表明高硒土壤中生長的中草藥含硒相對較多。本實(shí)驗(yàn)中不同地區(qū)羅漢果中硒含量并沒有表現(xiàn)出省份間差異變化的規(guī)律性，但是各地區(qū)硒含量差異顯著，表明不同土壤類型等可導(dǎo)致果實(shí)中的硒含量不同，因此，可通過改善種植區(qū)土壤硒含量等培育富硒羅漢果。

3 結(jié)論

由結(jié)果分析與討論可知，在廣西、湖南和四川等地，果齡相同時收獲羅漢果果實(shí)，其主要品質(zhì)指標(biāo)總皂苷和甜苷V接近傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的一般調(diào)查結(jié)果，即總皂苷含量在2.42%～3.34%之間，甜苷V含量在0.68%～1.42%之間，羅漢果甜苷V可達(dá)到藥典的0.5%的合格要求；不同產(chǎn)地間的羅漢果其總皂苷含量差異不顯著而甜苷V差異顯著，但這兩個指標(biāo)并沒有表現(xiàn)出隨緯度高低變化而在不同產(chǎn)地之間具有顯著差異的規(guī)律性特征，其原因可能在于，具體產(chǎn)地羅漢果果實(shí)發(fā)育期甜苷合成代謝存在差異，與具體產(chǎn)地果期有效積溫、水、肥、氣等栽培環(huán)境條件不同有關(guān)，因此，應(yīng)該根據(jù)年度氣候條件和農(nóng)藝管理等具體情況，通過抽樣檢測，建立合適的采收期，其具體影響還有待系統(tǒng)深入的研究。此外，本實(shí)驗(yàn)采用氫化物原子熒光光譜法首次對不同產(chǎn)地羅漢果硒含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地土壤條件下羅漢果中硒的含量具有顯著差異，為富硒優(yōu)質(zhì)羅漢果的種植提供了參考。