李劍鋒，仲毅，潘子寅，王志豪，潘樞，史宏?duì)N

（1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 胸外科，江蘇 揚(yáng)州 225001；2.揚(yáng)州大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，江蘇 揚(yáng)州 225001）

先天性氣管軟化塌陷狹窄或閉鎖，后天因外傷、腫瘤、大面積燒傷等原因引起的氣管損傷均會(huì)引起嚴(yán)重的呼吸困難甚至窒息。切除病變氣管并行端-端側(cè)吻合被普遍認(rèn)為是最有效的治療手段［1-2］。然而當(dāng)切除的病變氣管長(zhǎng)度超過(guò)成人的1/2或嬰幼兒的1/3 時(shí)，由于張力等原因無(wú)法行端-端側(cè)吻合，而需行氣管替代治療［3］。人類主氣管是由15～20 個(gè)C 形軟骨環(huán)通過(guò)平滑肌、血管等結(jié)締組織構(gòu)成，在內(nèi)表面被覆有纖毛上皮［4］。氣管軟骨維持著氣管的管腔形態(tài)，防止氣管塌陷；而氣管內(nèi)表面呼吸上皮中的纖毛對(duì)氣管的清潔有著重要作用；氣管軟骨周圍的結(jié)締組織則保證了氣管的曲伸以及收縮、擴(kuò)張等機(jī)械運(yùn)動(dòng)［5］。目前臨床上還無(wú)法完全重建如此復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，以及完全恢復(fù)其功能。然而，隨著氣管重建研究的深入，組織工程氣管的出現(xiàn)為氣管重建帶來(lái)了曙光［6］。

組織工程將種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子有效結(jié)合，從而修復(fù)相關(guān)組織缺損，進(jìn)行器官重建［7］。目前構(gòu)建組織工程氣管基質(zhì)材料主要有兩個(gè)來(lái)源：天然材料、合成材料［8］。而隨著研究的深入，目前天然材料主要來(lái)源多為同種異體氣管，本研究通過(guò)去污劑-聯(lián)合酶法（detergent-enzymatic method,DEM）獲取長(zhǎng)段無(wú)免疫原性脫細(xì)胞兔組織工程氣管，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)不影響血管生成性能，也不誘發(fā)體內(nèi)炎性反應(yīng)。 聚己內(nèi)酯（polycaprolactone,PCL）是一種生物可吸收性聚合物，因其分子鏈上的酯基使其具備良好的生物相容性，能夠在體內(nèi)以合適的速度自然降解并代謝出體外［9］。PCL 熔點(diǎn)低（60℃）、熱塑性良好，因而易加工成型，加之其良好的生物力學(xué)性能，獲得美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration,FDA）的批準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)以及組織工程［10-11］。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出200 μm 孔徑PCL 支架最利于細(xì)胞黏附增殖，并利用水解、胺化、納米材料修飾的方法，提高3D 打印聚己內(nèi)脂（PCL）氣管支架的表面親細(xì)胞性，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的黏附性能。本研究旨在通過(guò)對(duì)比兩種組織工程氣管基質(zhì)材料力學(xué)性能及生物相容性差別，為構(gòu)建更為有效的合理的組織工程氣管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

2 個(gè)月齡健康新西蘭兔3 只，雌雄不限，體重200～300 g；6 個(gè)月齡成年健康新西蘭兔25 只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg；均由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

脫氧膽酸鈉、DNA-I 酶、戊巴比妥（Sigma 公司，美國(guó)）；鹽酸賽拉嗪注射液（吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)（cell counting kit-8,CCK-8）試劑盒（Biosharp 公司，韓國(guó)）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；低分子肝素鈉（深圳天道醫(yī)藥有限公司）；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium, DMEM）、0.25%胰蛋白酶（HyClone 公司，美國(guó)）；F12（Clark 公司，美國(guó)）；Giemsa 染料（北京索萊寶科技有限公司）；青霉素、鏈霉素、兩性霉素B（上海生工生物工程有限公司）；即用型免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB） 顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；抗兔分化抗原68（cluster of differentiation 68,CD68）單克隆抗體（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）。

正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；萬(wàn)能力學(xué)測(cè)試機(jī)3367（Insteon 公司，美國(guó)）；LeicaCM-1990 冷凍切片機(jī)（Leica 公司，德國(guó)）；正置免疫熒光顯微鏡、TS100 倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；酶標(biāo)儀（BioTAK 公司，美國(guó)）；S-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)（Hereaus 公司，德國(guó)）；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；壓力蒸汽滅菌（嘉興中新醫(yī)療器械公司）。

1.2 BMSCs分離、培養(yǎng)及傳代

2 個(gè)月齡新西蘭兔，按鹽酸賽拉嗪0.2 ml/kg肌肉注射，麻醉成功后用18 號(hào)骨髓穿刺針于脛骨平臺(tái)處進(jìn)行穿刺，用經(jīng)肝素沖過(guò)的注射器抽取骨髓約2 ml。按本研究既往的實(shí)驗(yàn)方法［12］，即全骨髓貼壁篩選法進(jìn)行BMSCs 的分離、培養(yǎng)及傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4 代BMSCs 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 氣管支架制備及相關(guān)檢測(cè)

取10 只6 個(gè)月齡成年新西蘭兔，空氣栓塞法處死，在外科標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌操作下獲取氣管。隨機(jī)分為兩組，每組5 只。A1組僅剝離氣管外表面疏松結(jié)締組織。B1組在剝離氣管外表面疏松結(jié)締組織基礎(chǔ)上，參照本研究既往DEM 法［13］對(duì)氣管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，簡(jiǎn)述如下：①置于4℃蒸餾水滲透溶解48 h；②在4% 脫氧膽酸鈉蒸餾水溶液浸泡37℃孵育4 h；③將氣管在室溫下置2 000 KU/L Dnase-I 的生理鹽水中浸泡3 h；④將②③步驟重復(fù)7 次，最后將氣管置于1% 抗生素、抗真菌的PBS 緩沖液中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選用聚己內(nèi)酯（PCL）為材料，采用打印噴頭在旋轉(zhuǎn)軸上打印的方式，設(shè)置打印溫度為90℃，打印噴頭沿旋轉(zhuǎn)軸來(lái)回移動(dòng)，打印速度為5 mm/s，先在旋轉(zhuǎn)軸上打印出底層氣管支架；然后旋轉(zhuǎn)軸與打印底層時(shí)旋轉(zhuǎn)方向相反，打印成形第二層氣管支架，繼而與上一層形成多孔結(jié)構(gòu)。以此重復(fù)打印6 層。氣管支架的孔徑可通過(guò)旋轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)速和打印頭的行走速度調(diào)節(jié)，以此制備孔徑為200 μm的PCL 氣管支架。將支架置于濃度為10%的納米二氧化硅溶液中浸泡過(guò)夜，第二天取出后室溫放置，5 d 縮合反應(yīng)完全，得PCL 納米二氧化硅修飾材料。使用游標(biāo)卡尺對(duì)3組氣管支架進(jìn)行長(zhǎng)度、直徑、厚度等形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量。萬(wàn)能力學(xué)儀行壓縮實(shí)驗(yàn)：給予固定樣本0.1 N 為位移原點(diǎn)，室溫下以10 mm/min 的速率，控制行程為50%管腔直徑開(kāi)始?jí)嚎s實(shí)驗(yàn)［14］，記錄樣本最大應(yīng)力（N）。

1.4 細(xì)胞-氣管支架復(fù)合物的制備及相關(guān)觀測(cè)

1.4.1 細(xì)胞-氣管支架復(fù)合物制備及細(xì)胞活性觀察將A1組、B1組及C1組支架在無(wú)菌環(huán)境中修剪成0.5 cm×0.5 cm 大小的片狀組織，然后貼于96 孔板底中央，氣管外壁朝上；吸走周圍PBS 液，置于超凈臺(tái)中干燥2 h，向組織片中滴加含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基直至覆蓋組織片，滴加過(guò)程避免組織片漂浮。將96 孔培養(yǎng)板移至細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃、5%二氧化碳（CO2）、飽和濕度下孵育24 h 后，吸去培養(yǎng)基。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4 代BMSCs，達(dá)80% 融合時(shí)消化計(jì)數(shù)，然后將含有2.5×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種至兩組氣管組織片的外壁上，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h 后取出行Giemsa 染色，倒置顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及狀況判斷材料毒性。

1.4.2 掃描電鏡觀察 3組細(xì)胞-氣管支架復(fù)合物組織片培養(yǎng)24 h 后取出，2.5% 戊二醛溶液固定24 h；PBS 漂洗，梯度乙醇脫水，加入乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）及純戊酯各30 min，干燥后噴金，掃描電鏡觀察支架外表面的細(xì)胞狀態(tài)。

1.4.3 CCK-8 檢測(cè) 在避光條件下，以1∶10 的體積濃度配制CCK-8：培養(yǎng)基溶液。吸凈24 孔板內(nèi)待測(cè)孔中的培養(yǎng)基，加入500 μl CCK-8 檢測(cè)液覆蓋支架表面，置培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h；取200 μl 上清加入96 孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光值，減去空白對(duì)照的吸光值后得到間接反映活細(xì)胞數(shù)量的光學(xué)密度450（optical densitity 450,OD450）值。

1.5 同種異體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 氣管支架手術(shù)埋植 取6 個(gè)月齡成年新西蘭兔15 只，隨機(jī)分為3組，每組5 只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。以鹽酸賽拉嗪注射液0.2 ml/kg 肌肉注射麻醉，頸背部備皮切開(kāi)，游離皮下淺筋膜，分離脊柱一側(cè)，形成皮囊。每只兔子分別植入3組氣管支架一枚，隨后常規(guī)縫合。術(shù)后第一周每天予以青霉素5 萬(wàn)u/kg 一天一次肌肉注射，在術(shù)后30 d 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，獲取埋植物，拍照后將樣本在室溫下于pH7.4 的10%中性福爾馬林溶液固定24 h，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，石蠟包埋，并制成4 μm 切片備用。

1.5.2 血液免疫球蛋白動(dòng)態(tài)分析 術(shù)后3、7、11、15、19、23、27 d，于耳緣靜脈處采血留取標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法評(píng)估受體血清免疫球蛋白IgM 和IgG 含量的動(dòng)態(tài)變化。

1.5.3 HE 染色觀察 將制備好的切片依次行脫蠟、水化、染色、梯度脫水、透明、中性樹(shù)脂封片、干燥后正置光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 免疫組化檢查 將制備好的切片依次行脫蠟及水化、抗原修復(fù)（酶修復(fù)法）、滴加過(guò)氧化酶阻斷溶劑（A），室溫下孵育10 min 后滴加非免疫動(dòng)物血清（B），室溫下孵育10 min 后滴加用PBS稀釋的一抗（CD68 1∶200 稀釋），4℃孵育過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗（C），室溫下孵育10 min后滴加鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液（D），室溫下孵育10 min 后滴加新鮮配制的DAB 液顯色；蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、中性樹(shù)脂封片，干燥后顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氣管支架形態(tài)學(xué)觀測(cè)及生物力學(xué)性能檢測(cè)

兔原生氣管（Native）、 脫細(xì)胞氣管（Decellularized）、3D 打印氣管（材料為PCL）宏觀對(duì)比見(jiàn)圖1，各組測(cè)量的長(zhǎng)度、管腔直徑、及管壁厚度見(jiàn)表1，3組氣管支架形態(tài)學(xué)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組氣管支架形態(tài)學(xué)測(cè)量（±s,mm）

表1 3組氣管支架形態(tài)學(xué)測(cè)量（±s,mm）

組別原生氣管組脫細(xì)胞氣管組PCL氣管組t值P值例數(shù)5 5 5長(zhǎng)度50.23±0.31 49.63±1.3 50.24±0.51 1.51 0.108直徑8.61±0.35 8.34±0.26 8.75±0.17 1.27 0.156厚度0.88±0.05 0.86±0.08 0.87±0.04 0.76 0.238

圖1 3組氣管宏觀對(duì)比圖

壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果提示C1組力學(xué)性能優(yōu)于B1組，具有更好的側(cè)向抗壓維持管腔形狀能力。

表2 3組氣管支架生物力學(xué)性能對(duì)比（±s）

注：1）與原生氣管組比較，P ＜0.05；2）與脫細(xì)胞氣管組比較，P ＜0.05。

組別原生氣管組脫細(xì)胞氣管組PCL氣管組F值P值例數(shù)5 5 5管腔形變50%時(shí)最大應(yīng)力/N 2.261±0.165 1.414±0.2841)5.004±0.0011)2)298.82 0.000彈性模量/mPa 0.598±0.129 0.334±0.0581)1.744±0.1641)2)132.29 0.000

2.2 細(xì)胞-氣管支架復(fù)合物相關(guān)觀測(cè)

2.2.1 細(xì)胞活性觀察 培養(yǎng)48 h 后Giemsa 染色示，3組材料周圍的細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)良好，A1與B1兩組材料周圍的細(xì)胞在形態(tài)無(wú)明顯差別，B1組材料周圍局部密度較其他兩組更高，PCL 組可見(jiàn)少量懸浮細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

2.2.2 掃描電鏡觀察 培養(yǎng)24 h 后經(jīng)SEM 觀察到細(xì)胞在3組支架材料外壁上貼附良好，A1、B1組外側(cè)的網(wǎng)狀纖維上可見(jiàn)細(xì)胞呈扁平的圓形、橢圓形分布，BMSCs 在C1組材料外壁上呈簇狀生長(zhǎng)，局部為串珠樣分布，如圖3。

2.2.3 CCK-8 檢測(cè) CCK-8 試劑中含有WST-8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪-硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。統(tǒng)計(jì)分析各組不同時(shí)段的OD 值，見(jiàn)表3。B1組的細(xì)胞增殖數(shù)量要高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 3組細(xì)胞-氣管支架復(fù)合物培養(yǎng)48 h 后Giemsa 染色觀察（倒置顯微鏡×40）

圖3 種細(xì)胞前后3組細(xì)胞-氣管支架材料掃描電鏡觀察

2.3 同種異體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 大體觀察 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后30 d 內(nèi)表現(xiàn)健康，體重有所增加；傷口均愈合良好。30 d 時(shí)B2組氣管支架周圍包繞炎性結(jié)締組織，并與受植床粘連，不易剝離；囊狀的新鮮氣管內(nèi)有大量膿液積聚，破壞了正常氣管的解剖結(jié)構(gòu)；C2組被炎性肉芽組織包裹，易剝離。見(jiàn)圖4。

2.3.2 血液免疫球蛋白動(dòng)態(tài)分析 術(shù)后3組IgM及IgG 表達(dá)均逐漸增加，分別于1 d 和15 d 達(dá)峰值，后逐漸下降，符合體液免疫應(yīng)答抗體產(chǎn)生的規(guī)律。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)C2組IgM 和IgG 含量均顯著高于B2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

2.3.3 HE 染色觀察 術(shù)后30 d A2組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，腺體結(jié)構(gòu)缺失，軟骨組織不同程度被破壞；C2組以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，呈異物肉芽腫性炎癥反應(yīng)，結(jié)構(gòu)保持良好，而B(niǎo)2組較其他兩組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最少，軟骨細(xì)胞形態(tài)無(wú)異常，未見(jiàn)鈣化、排斥等不良反應(yīng)。見(jiàn)圖6。

表3 3組材料上種植干細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)CCK-8 檢測(cè)（±s,×104個(gè)/ml）

表3 3組材料上種植干細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)CCK-8 檢測(cè)（±s,×104個(gè)/ml）

注：1）與原生氣管比較，P ＜0.05；2）與脫細(xì)胞氣管比較，P ＜0.05。

組別A1(原生氣管)B1(脫細(xì)胞氣管)C1(3D打印氣管)F值P值例數(shù)5 5 5 1 d 0.080±0.002 0.104±0.0111)0.091±0.0052)11.04 0.017 3 d 0.134±0.006 0.216±0.0211)0.131±0.0202)24.32 0.001 5 d 0.421±0.014 0.495±0.0111)0.444±0.0112)28.84 0.001 7 d 0.417±0.015 0.455±0.028 0.438±0.012 2.9 0.132

2.3.4 免疫組化 術(shù)后30 d A2組基質(zhì)斷裂，軟骨凹陷內(nèi)細(xì)胞核消失，可見(jiàn)黏膜及黏膜下層內(nèi)有大量CD68 表達(dá)陽(yáng)性巨噬細(xì)胞，細(xì)胞膜呈棕色；C2組結(jié)構(gòu)保持完整，管腔內(nèi)側(cè)同樣可見(jiàn)CD68 表達(dá)陽(yáng)性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；B2組巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于上述兩組。見(jiàn)圖7。

圖4 埋植前后對(duì)比圖（30 d）

圖5 術(shù)后免疫球蛋白動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果

圖6 術(shù)后30 d HE 染色（A、B、C×100）

圖7 術(shù)后30 d 免疫組化CD68 抗原染色（A、B、C×100）

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)是組織工程的重要組成部分，是種子細(xì)胞生存的土壤，直接影響種子細(xì)胞黏附、增殖、分化，最終促進(jìn)組織再生和重塑［15-16］。目前不管是以脫細(xì)胞基質(zhì)為基礎(chǔ)［17］，還是以生物合成支架為基礎(chǔ)［18］的方法都被廣泛用于組織工程氣管研究。脫細(xì)胞基質(zhì)材料含有天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分，不會(huì)釋放有毒的可降解產(chǎn)物或引起炎性反應(yīng)［19］。但同樣脫細(xì)胞體外處理周期時(shí)間較長(zhǎng)、處理環(huán)節(jié)多，消耗較多人力、物力以及污染風(fēng)險(xiǎn)較大，缺乏供體來(lái)源等都一定程度限制其發(fā)展［20］。而通過(guò)3D 打印技術(shù)制備的PCL 氣管支架具有：①精度高；②速度快，周期短；③個(gè)體化；④種子細(xì)胞與支架材料同步化［21-22］等優(yōu)點(diǎn)。如何利用這兩種基質(zhì)材料的優(yōu)點(diǎn)構(gòu)建更加合理有效的人工氣管成為目前組織工程氣管的研究熱點(diǎn)。

氣道的重建首先有合適的外形和強(qiáng)度來(lái)維持其管腔的形態(tài)［23］，若無(wú)法維持管腔形態(tài)術(shù)后早期即可能出現(xiàn)管腔塌陷、狹窄等情況。通過(guò)力學(xué)性能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCL 氣管支架較脫細(xì)胞氣管支架有明顯優(yōu)勢(shì)。而脫細(xì)胞支架力學(xué)性能的下降考慮與在脫細(xì)胞過(guò)程中氣管中的可溶性膠原等的喪失有關(guān)［24］。

要成為可應(yīng)用于臨床的組織工程氣管支架材料，必須能支持種子細(xì)胞黏附、增殖、分化。本實(shí)驗(yàn)將BMSCs 接種至兩種氣管支架外壁上進(jìn)行體外培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)情況。SEM 結(jié)果顯示，BMSCs 在兩種氣管支架外壁上均貼附良好，細(xì)胞呈扁平的圓形、橢圓形，排列緊密，成簇分布，甚至可以看到PCL 基質(zhì)材料表面附著有更多的細(xì)胞。因此，推測(cè)脫細(xì)胞基質(zhì)與修飾后的PCL 氣管基質(zhì)材料均可以提供一個(gè)良好的細(xì)胞黏附界面，并且可以提供細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的環(huán)境。PCL材料表面附著有更多的細(xì)胞考慮與材料適宜的孔徑結(jié)構(gòu)以及修飾后原本疏水材料表面可供黏附的附著點(diǎn)增加有關(guān)［25］。而Giemsa 染色及CCK-8 檢測(cè)均提示，脫細(xì)胞氣管組細(xì)胞毒性最小，所能提供的環(huán)境最有利于細(xì)胞增殖。所以，PCL 氣管支架雖更有利于細(xì)胞黏附，但其生長(zhǎng)增殖的環(huán)境不及脫細(xì)胞氣管支架。

生物材料的性能要求一方面必須滿足功能性，另一方面必須滿足與生物長(zhǎng)期或短期接觸所需要的與生物體的相容性［26］。本研究中術(shù)后監(jiān)測(cè)血清中IgG、IgM 的變化，標(biāo)本取出后行HE 染色及免疫組化巨噬細(xì)胞特異性抗原CD68 檢測(cè)。根據(jù)免疫球蛋白的監(jiān)測(cè)情況，IgM 首先出現(xiàn)峰值，IgG 則在2 周以后達(dá)到最高峰，這與這兩種球蛋白自身特點(diǎn)相符，2 周時(shí)PCL 氣管組IgG 與IgM 均明顯高于另兩組，到4 周時(shí)3組結(jié)果基本一樣，說(shuō)明在炎癥反應(yīng)的急性期PCL 氣管組對(duì)于機(jī)體的刺激較其他兩組高。HE 染色可見(jiàn)原生氣管組內(nèi)有大量的單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等浸潤(rùn)，呈現(xiàn)非特異性慢性炎癥，PCL 支架則以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，呈現(xiàn)異物肉芽腫性炎癥。兩者截然不同的炎癥反應(yīng)結(jié)果，考慮與材質(zhì)的本身表面的抗原有關(guān)系，PCL 支架表面無(wú)抗原，無(wú)法形成抗原遞呈反應(yīng)，最終結(jié)果會(huì)形成纖維包裹和異物肉芽腫，另外可出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，這可能是異物刺激引起自身免疫反應(yīng)的結(jié)果［27］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)脫細(xì)胞氣管支架及PCL 氣管材料的體外、體內(nèi)生物學(xué)性能檢測(cè)，證實(shí)PCL 氣管支架具有良好的生物力學(xué)性能，脫細(xì)胞氣管具有低免疫原性、適宜細(xì)胞增殖及良好的生物相容性，兩種支架材料的相對(duì)優(yōu)勢(shì)可為構(gòu)建多層結(jié)構(gòu)雜化式組織工程氣管提供依據(jù)。