王雪蓮，李響明*，王文鵬，周永妍，孫勝斌

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北 石家莊 051430)

參麥注射液為紅參和麥冬提取有效成分制成的純中藥注射液制劑，主要以人參皂苷類和糖類為主要有效成分[1]。參麥注射液具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈的作用，臨床用于冠心病、休克、病毒性心肌炎等多種疾病的治療，為臨床常用中藥注射液品種之一[2-3]。大分子物質(zhì)被廣泛認(rèn)為是引起中藥注射液中不良反應(yīng)的源頭[4]，受生產(chǎn)工藝及存放環(huán)境等因素影響，制劑中可能存在少量鞣質(zhì)與蛋白質(zhì)成分等大分子物質(zhì)。在中藥注射液生產(chǎn)過程中去除了絕大多數(shù)的大分子物質(zhì)，而制劑中大分子物質(zhì)的分子量分布，現(xiàn)有法定標(biāo)準(zhǔn)中鮮有控制。本實驗采用高效分子排阻色譜法[5]對參麥注射液及其中間體藥液測定其相對分子質(zhì)量及分布，為參麥注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)[6-8]。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜；Alltech ELSD6000型蒸發(fā)光散射檢測器；凝膠柱TSK-Gel GPWXL4000，7.8mm×300mm；四元梯度泵，CPA225D電子天平(德國賽多利斯)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KH3200E型超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。乙腈(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純。

1.2 樣品及對照品

參麥注射液(市售產(chǎn)品)及參麥注射液中間體。右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)套對照品相對分子質(zhì)量分別為D0(相對分子質(zhì)量180，批號140637-201203)、D1(相對分子質(zhì)量2 700，批號140638-201203)、D2(相對分子質(zhì)量5 250，批號140639-201203)、D3(相對分子質(zhì)量9 750，批號140640-201203)、D4(相對分子質(zhì)量13 050，批號140641-201203)、D5(相對分子質(zhì)量36 800，批號140642-201203)、D6(相對分子質(zhì)量64 650，批號140643-201203)、D7(相對分子質(zhì)量135 350，批號140644-201203)、D8(相對分子質(zhì)量300 600，批號140645-201203)，均購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 色譜條件 凝膠柱(TSK-Gel GPWXL4000，7.8 mm×300 mm)，以10 mmol·L-1醋酸銨溶液為流動相，柱溫40 ℃，流速為0.6 mL·min-1，蒸發(fā)光散射檢測器(干燥氣體流速3.0 L·min-1；漂移管溫度115 ℃)。

2.1.2 對照品溶液制備 取右旋糖酐D0～D8對照品，精密稱定，加水分別制成每1 mL約含2 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取參麥注射液過0.45 μm微孔濾膜，即得。參麥中間體藥液稀釋至每mL含紅參0.1 g生藥或麥冬0.1 g生藥濃度，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀測定。將所得的一系列對照品溶液的色譜保留時間為橫坐標(biāo)X，對照品標(biāo)準(zhǔn)分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)Y，作二次回歸方程，計算供試品溶液的分子量分布，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗 取空白溶劑水測定，結(jié)果見圖1，溶劑對結(jié)果無影響。

圖1 溶劑色譜

右旋糖酐系列標(biāo)準(zhǔn)品色譜見圖2。

注：按保留時間由大到小，依次為右旋糖酐對照品D0-D8。

2.2.2 線性范圍考察 取右旋糖酐對照品溶液，按“2.1.4”注入高效液相色譜儀，采用ELSD檢測，記錄對照品保留時間。以對照品的標(biāo)準(zhǔn)分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)Y，相應(yīng)的對照品色譜峰保留時間為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行二次回歸，回歸方程為Y=-0.060 7X2+1.334 5X-2.280 5，R2=0.982 9，r=0.991 0。

2.2.3 精密度試驗 取D4(相對分子質(zhì)量13 050)對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算保留時間RSD為0.17%，峰面積RSD為0.57%，表明系統(tǒng)精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取SM-1批按“2.1.4”制備供試品溶液，在室溫放置0、4、8、12、16、24h時分別進(jìn)樣測定，計算各峰保留時間的RSD分別為0.14%、0.11%、0.18%，各峰峰面積RSD分別為3.94%、3.87%、0.33%，表明供試品在室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗 取SM-1批按“2.1.4”制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各峰保留時間RSD分別為0.07%、0.05%、0.08%，各峰峰面積RSD分別為2.36%、2.47%、0.18%，系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.3 樣品測定

2.3.1 成品測定 取10批市售成品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果見表1。

表1 10批市售成品檢測結(jié)果

2.3.2 中間體樣品測定 取3批參麥注射液中間體樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得以下結(jié)果，見表2、表3。

表2 參麥注射液中間體(紅參)檢測結(jié)果

表3 參麥注射液中間體(麥冬)檢測結(jié)果

從10批參麥注射液成品的測定結(jié)果可以看出，參麥注射液成品中物質(zhì)的相對分子質(zhì)量均小于8 000，其中98.7%物質(zhì)分子質(zhì)量小于380；分子量在3 300～3 460間的物質(zhì)約占總峰面積0.55%～0.56%；極少量分子質(zhì)量在7 800～7 950間的物質(zhì)約占總峰面積0.035%～0.047%。這應(yīng)該與參麥注射液產(chǎn)品中所含的人參皂苷類、糖類物質(zhì)有關(guān)。

結(jié)合文獻(xiàn)研究及生產(chǎn)工藝，在參麥注射液生產(chǎn)的關(guān)鍵工序取中間體，以考察精制工藝對大分子物質(zhì)的去除效果。紅參醇提液中最大分子質(zhì)量在80 000～92 000間，約占總峰面積0.15%～0.18%，經(jīng)過活性炭處理后該部分物質(zhì)占總峰面積的比例下降。經(jīng)過調(diào)堿、水沉后，可有效去除分子質(zhì)量大于10 000的物質(zhì)和極少量分子質(zhì)量7 000～8 000的物質(zhì)。麥冬醇提液中最大分子質(zhì)量在1 300～1 400間，可見提取出來的物質(zhì)分子量較小，再經(jīng)過活性炭處理、水沉后，不同分子量間的物質(zhì)所占總峰面積的百分?jǐn)?shù)變化不大。

3 討論

本研究建立了一種可用于檢測參麥注射液大分子物質(zhì)的相對分子質(zhì)量及分布方法，該方法操作簡單、便捷、分離度好，對該產(chǎn)品大分子物質(zhì)質(zhì)量控制具有重要意義，對其他注射液中大分子雜質(zhì)的限量檢查亦有借鑒作用，而且借助中間體的分子量分布結(jié)果可以評價精制工藝的有效性。

參麥注射液主要含有人參皂苷類成分和糖類成分，故本實驗以右旋糖酐為對照，主要測定支鏈型大分子物質(zhì)；是否存在鏈球型大分子物質(zhì)[9]還需進(jìn)一步研究。