張偉云，張 勇，徐晶晶，向云亞，陳全成

(1.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361023；3.廈門大學(xué) 藥學(xué)院，福建 廈門 361102)

降血糖作用是衡量某活性物質(zhì)是否具有防治2型糖尿病能力的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，選擇快速、直接、客觀、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?xì)胞葡萄糖吸收檢測(cè)方法用以評(píng)估待測(cè)化學(xué)成分的降血糖活性具有十分重大的意義。葡萄糖熒光示蹤劑2-[N-(7-硝基苯-2-氧代-1,3-重氮基-4-基)氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖(2-NBDG)在467 nm波長(zhǎng)被激發(fā)時(shí)，于542 nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，采用2-NBDG作為葡萄糖示蹤劑，利用流式細(xì)胞儀直接檢測(cè)單細(xì)胞吸收葡萄糖的方法[1]，不但克服了放射性示蹤劑無(wú)法測(cè)定單細(xì)胞吸收葡萄糖的缺點(diǎn)，同時(shí)也避免了放射性廢物處理的問題[2]，并且能夠客觀、快速、高效地獲取試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3T3-L1前脂肪細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后能促進(jìn)外部環(huán)境中的葡萄糖消耗。胰島素、胰島素類似物與不同酶和受體相互作用，通過激活細(xì)胞和細(xì)胞核中的多個(gè)信號(hào)通路，進(jìn)而加速成熟脂肪細(xì)胞對(duì)周圍葡萄糖的吸收、運(yùn)輸、消耗，最終使細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低。因而，3T3-L1前脂肪細(xì)胞系已被廣泛應(yīng)用于降糖藥物篩選模型[3-5]。

研究表明，油茶醇提取物可在一定程度上降低2型糖尿病小鼠的血糖濃度[6]，前期研究提示油茶醇提取物中的沒食子兒茶素沒食子酸酯很可能會(huì)在一定程度上加快細(xì)胞吸收葡萄糖。因此，本研究以羅格列酮為對(duì)照藥，對(duì)沒食子兒茶素沒食子酸酯在3T3脂肪細(xì)胞中對(duì)葡萄糖吸收的影響及其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的作用進(jìn)行了考察。

1 材料與儀器

1.1 藥品

葡萄糖、胰島素、羅格列酮均購(gòu)買于Sigma-Aldrich； 沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度>98%)購(gòu)買于成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.2 試劑

油紅O、蘇木精-伊紅溶液均購(gòu)自Sigma-Aldrich；葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG購(gòu)自Molecular Probes。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 儀器

試驗(yàn)中使用的主要儀器包括全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan Go，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司); 流式細(xì)胞儀(FACS Calibur flowcytometer，美國(guó)Becton Dickinson公司); CO2恒溫培養(yǎng)箱(IFS-110-8，新加坡Esco Micro Pte有限公司)。

1.4 細(xì)胞

小鼠源3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，用10%胎牛血清DMEM在5%CO2加濕空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37℃進(jìn)行培養(yǎng)，第5～9代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞活力測(cè)定

使用MTT法檢測(cè)，采用含有0.5 μM和1 μM沒食子兒茶素沒食子酸酯或羅格列酮的無(wú)血清DMEM處理48 h后，觀察3T3-L1前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖的情況，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組光密度值，設(shè)置空白對(duì)照組細(xì)胞對(duì)應(yīng)的光密度值為100%。

2.2 沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)脂肪細(xì)胞吸收葡萄糖的影響

參照文獻(xiàn)方法操作[7-15]，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG吸收的影響。以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度，將分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于含1 μM胰島素的無(wú)血清高濃度葡萄糖(30 mM)的DMEM中培養(yǎng)24 h，再分別用0.5 μM和1 μM的沒食子兒茶素沒食子酸酯及羅格列酮和10 μM 2-NBDG處理1 h，對(duì)照組則用無(wú)血清DMEM處理1 h。將收集的各組細(xì)胞懸浮于預(yù)冷的500 μL無(wú)血清但含高濃度葡萄糖(30 mM)的DMEM中，保持在4 ℃，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞吸收葡萄糖的情況，記錄各組細(xì)胞吸收2-NBDG的熒光強(qiáng)度值。用沒食子兒茶素沒食子酸酯或羅格列酮處理但未加2-NBDG進(jìn)行處理的對(duì)照組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別作為其測(cè)量背景值，以排除假陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)藥物處理組的熒光強(qiáng)度值與背景值之差，以作后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.3 油紅O染色和脂積累量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7-15]誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。按照4×103細(xì)胞/孔的密度，將3T3-L1前脂肪細(xì)胞種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，再用含1 μM胰島素和0.5 μM及1 μM的沒食子兒茶素沒食子酸酯或羅格列酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，對(duì)照組細(xì)胞則用含1 μM胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，12天后，進(jìn)行油紅O染色和脂含量測(cè)定。用10%福爾馬林溶液固定各組細(xì)胞1 h后，在室溫下用油紅O溶液染色2 h，接著用蘇木精-伊紅染色15 min。為了去除游離染料，用60%異丙醇溶液輕柔清洗各組細(xì)胞3次。應(yīng)用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組細(xì)胞的脂積累量。在光學(xué)顯微鏡下拍攝(400×)各組細(xì)胞油紅O的染色情況，用以對(duì)比和評(píng)估沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程的影響。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活力的影響

以空白對(duì)照組細(xì)胞光密度值為100%，與空白對(duì)照組相比，沒食子兒茶素沒食子酸酯和羅格列酮在0.5 μM和1 μM濃度下均對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖沒有顯著影響，提示沒食子兒茶素沒食子酸酯和羅格列酮對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，不破壞細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。如圖1所示。

圖1 沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活力的影響(n=6)

3.2 沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)葡萄糖吸收的影響

采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型，測(cè)定沒食子兒茶素沒食子酸酯在3T3-L1脂肪細(xì)胞中對(duì)胰島素刺激的葡萄糖熒光示蹤劑2-NBDG吸收的作用。與對(duì)照組相比，0.5 μM和1 μM羅格列酮可顯著促進(jìn)在高濃度葡萄糖(30 mM)條件下3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素刺激的葡萄糖吸收(圖2)。沒食子兒茶素沒食子酸酯在1 μM的濃度下也可顯著增加3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素調(diào)節(jié)的2-NBDG吸收，并且比1 μM羅格列酮體現(xiàn)出更強(qiáng)的趨勢(shì)。

注：n=6, 與對(duì)照組比較，** P< 0.01。

3.3 沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

相對(duì)于空白對(duì)照組3T3-L1前脂肪細(xì)胞(圖 3A)，對(duì)照組細(xì)胞(圖 3B)受到胰島素的影響出現(xiàn)了少量成熟的脂肪細(xì)胞，新生成的成熟脂肪細(xì)胞被油紅O染成紅色。與對(duì)照組細(xì)胞(圖 3B)相比，1 μM羅格列酮可明顯加速脂肪分化，出現(xiàn)了較多成熟的脂肪細(xì)胞(圖 3D)，還可促進(jìn)脂積累(圖4)。在1 μM的濃度下，沒食子兒茶素沒食子酸酯也體現(xiàn)出與羅格列酮相似的活性，可明顯促進(jìn)脂肪分化(圖3F)，顯著增加脂含量(圖4)。

注：(A)空白組；(B)胰島素處理組；(C)0.5 μM羅格列酮處理組；(D)1 μM羅格列酮處理組；(E)0.5 μM沒食子兒茶素沒食子酸酯處理組；(F)1 μM沒食子兒茶素沒食子酸酯處理組。

圖3 沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

注：n=6，設(shè)定對(duì)照組中脂的含量為100%；與對(duì)照組比較，**P<0.01。

圖4 沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)3T3-L1前脂肪
細(xì)胞分化過程中脂含量的影響

4 討論

沒食子兒茶素沒食子酸酯可顯著提高分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞在高濃度葡萄糖條件下對(duì)胰島素刺激條件下的葡萄糖吸收，這表明沒食子兒茶素沒食子酸酯可能具有降低血糖的潛能，但需要深入研究其作用機(jī)制。

上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)表達(dá)能顯著提高胰島素敏感性[16-18]。PPARγ2選擇性表達(dá)于脂肪細(xì)胞中，其表達(dá)離不開脂肪細(xì)胞分化過程[19]。因此，能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的化合物很可能具有改善胰島素敏感性和提高胰島素刺激的葡萄糖吸收的潛力[7-15]。試驗(yàn)結(jié)果提示沒食子兒茶素沒食子酸酯促進(jìn)了3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化過程，這可能是沒食子兒茶素沒食子酸酯加快脂肪細(xì)胞中胰島素刺激的葡萄糖吸收的一個(gè)原因，但這仍需進(jìn)一步研究。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，沒食子兒茶素沒食子酸酯不僅促進(jìn)了分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的葡萄糖吸收，而且加速了3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化過程。因此，沒食子兒茶素沒食子酸酯可能具有降低血糖和改善胰島素抵抗的潛能，這對(duì)于預(yù)防或輔助治療2型糖尿病具有重要意義。