汪艷杰，許國權(quán)，郭 瑞，胡志輝

(江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056)

電泳法是生物化學(xué)中非常重要的一項(xiàng)技術(shù)。醋酸纖維素薄膜電泳由于其微量、快速、簡便、分辨力高等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于血清蛋白、糖蛋白等生物大分子的分離與檢測。其中醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)是采用醋酸纖維素薄膜為支持物的電泳方法，醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將其溶于有機(jī)溶劑(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹均勻的薄膜即為醋酸纖維素薄膜[1]。醋酸纖維素薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：對蛋白質(zhì)樣品的吸附極少，分離條帶清晰。由于醋酸纖維素薄膜親水性比濾紙小，薄膜中所容納的緩沖液也少，電泳時的電流是由樣品傳導(dǎo)的，分離速度快，所需時間短，一般60 min左右即可。染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，可以制成透明的干板，便于保存和定量分析。

用醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白的主要原理是：血清中的各種蛋白組分分子量不同，以及在同一緩沖體系下所帶凈電荷也存在差異(當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pH大于等電點(diǎn)時，該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動[2])，在同一電場下其泳動速率就不同，從而使血清中的各種蛋白組分得以分離[3]。但是，在醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)步驟相對較多，受人為操作因素和環(huán)境因素影響較大，因此，需對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不斷改進(jìn)和完善，從而提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和效率。

1 材料與方法

1.1 試劑、薄膜及電泳槽

1.1.1 試劑配制 染色液：氨基黑B：0.5 g，甲醇50 mL，冰醋酸10 mL，蒸餾水40 mL，混勻。漂洗液：95%乙醇45 mL，冰醋酸5 mL，水50 mL。透明液：無水乙醇∶冰醋酸=7∶3。健康人血清(新鮮，無溶血現(xiàn)象)。

1.1.2 醋酸纖維素薄膜準(zhǔn)備 取2 cm×8 cm的薄膜條若干，將薄膜小心地放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使它漂浮在液面，用鑷子輕壓，使它全部浸入緩沖液內(nèi)，待膜完全浸透(約30 min)后待用。

圖1 實(shí)驗(yàn)中所用的醋酸纖維素薄膜

1.1.3 制作“濾紙橋” 剪裁尺寸合適的濾紙條，雙層貼附在電泳槽的支架上，使濾紙條的一端與膜支架的前沿對齊，而另一端浸入電泳槽的緩沖液內(nèi)。此電泳槽中間為負(fù)極，兩端為正極。此外，一定要注意清除氣泡，使濾紙緊貼在膜支架上。見圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)中所用的水平電泳槽及濾紙橋

1.2 點(diǎn)樣

用鑷子取出醋酸纖維素薄膜，夾在干凈的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，在膜的無光澤面上作好標(biāo)記。把薄膜鋪在載玻片上(無光澤面朝上)，將蓋玻片在血清中輕輕劃一下(量薄薄一層最好)，再在膜條無光澤面的一端1.5～2 cm處輕輕地水平落下并迅速提起，即在膜條上點(diǎn)上細(xì)條狀的血清樣品。見圖3。

圖3 醋酸纖維素薄膜點(diǎn)樣位置

1.3 電泳

將已點(diǎn)樣的薄膜使無光澤面向下，貼于電泳槽支架的“濾紙橋”上，薄膜一定要繃直，中間不能塌陷，蓋上電泳槽蓋之后，平衡10 min。以薄膜每厘米長度電壓為10 V左右，薄膜每厘米寬的電流強(qiáng)度為 0.4～0.6 mA，通電時間為60 min。

1.4 染色

電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色10 min。

1.5 漂洗

將染色完畢的薄膜自染液中取出，自來水下沖洗除去多余的染色液后，直接放入漂洗液中，連續(xù)更換幾次漂洗液，直到薄膜背景幾乎無色為止。取出薄膜放在濾紙上，用吹風(fēng)機(jī)將薄膜吹干。

1.6 透明

將脫色吹干后的薄膜進(jìn)入透明液中，浸泡2～3 min后，取出緊貼于潔凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，干后即為透明薄膜圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 點(diǎn)樣質(zhì)量控制

醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)中，點(diǎn)樣非常關(guān)鍵，會直接影響電泳圖譜的好壞。經(jīng)過幾年的教學(xué)實(shí)踐，筆者對學(xué)生強(qiáng)調(diào)了幾點(diǎn)細(xì)節(jié)，可以提高學(xué)生電泳圖譜的成功率。主要有以下幾個方面：①點(diǎn)樣前薄膜要充分浸透緩沖液，筆者認(rèn)為過夜浸泡更合適；②將薄膜夾在雙層濾紙中輕壓吸去表面的多余水分，一定要注意不要將薄膜水分吸至過干(薄膜發(fā)白)，從而影響薄膜對血清蛋白的吸收，標(biāo)準(zhǔn)是薄膜表面沒有明顯的液體，如果薄膜發(fā)白則重新取一張新的薄膜；③自制點(diǎn)樣器：有些教材使用的點(diǎn)樣器是蓋玻片，在實(shí)驗(yàn)中蓋玻片點(diǎn)樣量較大，電泳圖譜效果不好。筆者選擇的點(diǎn)樣器是X光片裁制而成，邊緣清晰，厚度適中，點(diǎn)樣量適中，不能重復(fù)點(diǎn)樣，點(diǎn)樣結(jié)束后，點(diǎn)樣處形成一條粗細(xì)均勻的淡黃色直線。見圖4。

2.2 改善透明過程

用鑷子將薄膜取出，貼在容器壁上(燒杯壁或培養(yǎng)皿上等)，注意不可有氣泡，用吹風(fēng)機(jī)稍吹干薄膜，用膠頭滴管淋洗薄膜，將每組20 mL透明液淋洗玩即可，再用吹風(fēng)機(jī)將薄膜徹底吹干，此時薄膜透明，小心將薄膜自容器壁上取下，則成為可長期保存的血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳圖譜。

透明過程直接影響到電泳圖譜的好壞，故對學(xué)生強(qiáng)調(diào)以下幾點(diǎn)：將薄膜貼在平整的玻璃器皿表面，例如培養(yǎng)皿背面、燒杯外壁等等位置，注意薄膜與玻璃之間貼合緊密，無氣泡存在。用膠頭滴管將透明液滴在薄膜上，滴透明液的過程中易產(chǎn)生氣泡，故對學(xué)生強(qiáng)調(diào)，將玻璃器皿稍微傾斜，傾斜角度不要過大，將透明液滴在薄膜表面。當(dāng)薄膜呈現(xiàn)膠狀時，停止滴加透明液，用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干即可。

2.3 電壓的影響

見圖5，相同的血清樣品在不同電壓條件下，醋酸纖維素薄膜電泳的圖譜有一定的差異，電壓110 V時，條帶清晰，電壓90 V時，條帶有些彌散。故在本實(shí)驗(yàn)條件下，110 V電壓，電泳時間1 h，能夠得到更為清晰的條帶。

圖4 自制點(diǎn)樣器點(diǎn)樣效果

圖5 左側(cè)電壓110 V，右側(cè)電壓90 V

2.4 優(yōu)化后的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜

一般透明后的薄膜上可顯現(xiàn)清楚的5條區(qū)帶，從正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。如圖5所示，筆者對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行改進(jìn)后，電泳圖譜條帶分離清晰，無拖尾現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想。

從上之下依次為：清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白

3 實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)的錯誤結(jié)果及原因分析

3.1 條帶拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重

見圖6，醋酸纖維素薄膜電泳圖譜條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，原因是血清樣品不是新鮮的，或者電泳時電流過大。

圖7 條帶拖尾的薄膜

3.2 條帶未分開

有的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜條帶未分開，但是其他同時進(jìn)行的圖譜條帶正常分離，可能的原因是樣品量過多，或者醋酸纖維素薄膜上的水分未用濾紙吸干，或者在點(diǎn)樣完成后，樣品未完全被薄膜吸收而發(fā)生位移或者迅速擴(kuò)散，濃度降低而導(dǎo)致區(qū)帶分散不集中[4]。

3.3 條帶斷裂不整齊

醋酸纖維素薄膜電泳圖譜可以出現(xiàn)5條帶，但是每條帶中間出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，如圖7所示，是因?yàn)檠鍢悠妨枯^少，點(diǎn)樣不均勻。故用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣前，要確保點(diǎn)樣器已經(jīng)清潔干凈，均勻沾取血清樣品，觀察點(diǎn)樣器邊緣的血清樣品是否均勻完整。在實(shí)驗(yàn)正式開始前，讓學(xué)生不斷地練習(xí)正確點(diǎn)樣過程，點(diǎn)樣效果達(dá)到圖4的效果后，再正式點(diǎn)樣。否則會直接影響實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果。

圖8 條帶斷裂

圖9 條帶歪斜

3.4 條帶歪斜

見圖8，醋酸纖維素薄膜電泳圖譜歪斜，不整齊，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是點(diǎn)樣時的點(diǎn)樣區(qū)歪斜，或者將薄膜放置在電泳槽中時放置歪斜。

要想取得醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)的成功，對實(shí)驗(yàn)的每一步都應(yīng)嚴(yán)格控制，尤其是點(diǎn)樣和透明環(huán)節(jié)的控制與熟練程度，是實(shí)驗(yàn)成敗的重要條件?？刂坪眠@兩點(diǎn)，就會得到質(zhì)量合格的電泳圖譜，從而提高實(shí)驗(yàn)效率。