顧瑩婕 金恩惠 李 博 何普明 吳媛媛 屠幼英

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系 杭州310058）

我國(guó)人群中口腔健康狀況不容樂(lè)觀，患齲率逐年上升，牙齦出血、牙周炎等問(wèn)題普遍發(fā)生[1]。齲齒、牙周炎、口臭等口腔疾病主要由致病菌引起[2]，嚴(yán)重影響人體健康和社會(huì)交往。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）和遠(yuǎn)緣鏈球菌（Streptococcus sobrinus）為主要致齲菌，通過(guò)分泌葡糖基轉(zhuǎn)移酶分解糖產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙齒脫礦引發(fā)齲齒[3-4]。牙齦卟琳單胞菌（Porphyromonas gingivalis）與中間普氏菌（Prevotella intermedia）分泌促炎因子引起牙周炎[5-6]。具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）和Solobacterium moorei 誘導(dǎo)產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物引起口臭[7-8]。白色念珠菌（Canidia Albicans）可誘發(fā)口腔扁平苔蘚病[9]。

廣譜抗生素和化學(xué)合成藥雖可有效殺滅口腔致病菌，但也會(huì)對(duì)口腔微生態(tài)造成不同程度的破壞，引起菌群失調(diào)及潰瘍等問(wèn)題[10]。開(kāi)發(fā)低毒、高效的天然植物藥具有重要的研究意義。茶葉含有茶多酚等天然抑菌成分，并被臨床研究證實(shí)具有防治口腔疾病的作用。Ooshima 等[11]用烏龍茶提取物連續(xù)沖洗志愿者的口腔，1 周后牙菌斑沉積量明顯減少。Awadalla 等[12]用2%綠茶溶液沖洗牙科病人口腔后變形鏈球菌數(shù)目下降20.9%，牙齦出血指數(shù)GBI 降低52.5%，證實(shí)了綠茶的抗菌防齲齒效果。杜德順等[13]通過(guò)給兒童飲用含茶飲料，兩年后研究結(jié)果顯示：飲茶組兒童患齲率明顯降低。王萍[14]將復(fù)方茶多酚含漱液局部應(yīng)用于牙周炎患治療中，發(fā)現(xiàn)齦下菌斑微生物量減少29.9%，齦溝液內(nèi)毒素含量降低73.8%，牙周炎治療效果顯著提高。此外，茶多酚對(duì)于復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者具有縮短病程，減少潰瘍數(shù)目，延長(zhǎng)復(fù)發(fā)周期的效果[15]。

基于茶葉在防治口腔疾病中的優(yōu)異性，筆者系統(tǒng)探討了茶藥理成分對(duì)口腔主要致病菌的作用效果，著重討論其抑菌的分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步高效利用提供思路和方向。

1 茶葉藥理成分抑制口腔致病菌的作用

1.1 兒茶素類

茶多酚最早被研究證實(shí)具有預(yù)防齲病的功效，其對(duì)致齲菌如變形鏈球菌、粘性放線菌，口腔致臭菌如中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌均有較好的抑制效果[16]。2005年，王琳[17]和劉建國(guó)等[18]的研究顯示茶多酚對(duì)致臭菌的作用極佳，可望用于治療口臭。隨著分離純化技術(shù)的日趨成熟，茶多酚的主要成分——兒茶素單體類成為研究的焦點(diǎn)。茶多酚及兒茶素抑制口腔細(xì)菌的作用效果見(jiàn)表1。從最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）來(lái)看，不同菌株對(duì)藥物的敏感性存在差異，兒茶素單體特別是EGCG 對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制活性尤其強(qiáng)烈。

表2 茶黃素對(duì)不同口腔致病菌的MIC 與MBC 值Table 2 MIC and MBC value of theaflavins on different oral pathogens

1.2 茶黃素類

茶黃素（TFs）是茶葉加工過(guò)程中多酚類化合物氧化形成的一類具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，其中茶黃素（TF）、茶黃素-3-單沒(méi)食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3’-單沒(méi)食子酸酯（TF-3’-G）和茶黃素-3，3’-雙沒(méi)食子酸酯（TF-3，3’-G）為4 種主要的單體成分。隨著茶黃素單體成分分離制備技術(shù)的日趨成熟，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)茶黃素的抑菌功效開(kāi)展相關(guān)研究。2013年，Shahzad 等[19]發(fā)現(xiàn)茶黃素在質(zhì)量濃度0.125 mg/mL 可有效抑制鏈球菌、伴防線放線桿菌、具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)；Sitheeque 等[20]研究證實(shí)茶黃素對(duì)真菌如白色念珠菌也有一定的抑制作用。茶黃素抑制口腔致病菌的作用效果見(jiàn)表2。

表2 茶黃素對(duì)不同口腔致病菌的MIC 與MBC 值Table 2 MIC and MBC value of theaflavins on different oral pathogens

1.3 茶皂素

目前有關(guān)茶皂素對(duì)口腔致病菌的研究相對(duì)較少。2007年，黎先勝[21]用管碟法研究了茶皂素的體外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)白色念珠菌的抑制效果明顯，最小抑菌質(zhì)量濃度僅為0.0625 mg/mL。2013年，Joshi 等[22]成功分離茶籽皂苷中的S1、S2、S3、S44 個(gè)組分對(duì)白色念珠菌均有良好的抑菌效果。2015年，Kim 等[23]發(fā)現(xiàn)綠茶籽總皂苷及6 個(gè)皂苷組分可有效抑制變形鏈球菌生長(zhǎng)，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。以假絲酵母菌、白色念珠菌引起的口腔真菌感染可引起口腔內(nèi)局部炎癥、腫脹疼痛、潰瘍和紅斑以及味覺(jué)異常和口腔黏膜增生等[24]，而茶皂素由于對(duì)白色念珠菌的優(yōu)異抗性，可應(yīng)用于多種口腔疾病的治療。

1.4 其它組分

茶葉精油主要是由單萜、倍半萜及其相應(yīng)醇組成的萜烯類化合物。1993年，Muroi 等[25]研究發(fā)現(xiàn)綠茶精油中倍半萜類 （δ-杜松萜烯和β-石竹烯）具有抗變形鏈球菌活性，與吲哚聯(lián)用可呈現(xiàn)協(xié)同增效的作用。

2 兒茶素及茶黃素的抑菌機(jī)制

茶葉中的兒茶素及茶黃素類最為廣泛地用于各類抑菌試驗(yàn)和臨床研究，其對(duì)于口腔致病菌的作用機(jī)理主要可歸納為以下幾個(gè)方面：

2.1 抑制口腔致病菌粘附口腔細(xì)胞和生物膜形成

口腔內(nèi)牙菌斑是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)菌生物膜群體，其組成與細(xì)菌的粘附和共聚密切相關(guān)[26]。有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素濃度對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)及粘附的抑制呈相關(guān)性，當(dāng)兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.125%～1.000%時(shí)，菌斑的形成能力及菌粘附能力顯著減弱[27-28]。1996年，Sakanaka 等[29]比較了各兒茶素單體成分對(duì)牙齦卟啉單胞菌的作用，發(fā)現(xiàn)具有沒(méi)食子?；腅GCG 單體抑制卟啉單胞菌生長(zhǎng)及其粘附口腔上皮細(xì)胞的效果最佳。2015年，Morin 等[30]證實(shí)了質(zhì)量濃度在125～250 μg/mL 區(qū)間的EGCG可顯著抑制Solobacterium moorei 粘附口腔上皮細(xì)胞，并減少細(xì)菌生物膜的形成。生物膜的形成在變形鏈球菌細(xì)胞的致齲毒性中很關(guān)鍵[31]。據(jù)Xu[32]研究顯示，31.25 mg/mL 的EGCG 在1 h 內(nèi)可使變形鏈球菌UA159 的粘附抑制率達(dá)到79.57%，作用2 h 可達(dá)98.33%。另外，具核梭桿菌在生成引起破壞性牙周炎的致病性齦下生物膜中起關(guān)鍵作用，而62.5 μg/mL 的EGCG 可減少55.4%的生物膜形成并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)破壞更嚴(yán)重，效果高于氯已定[33]。

2.2 破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)含物滲漏

早在1993年就有研究證實(shí)EGCG 可引起脂質(zhì)體內(nèi)包裹的小分子發(fā)生滲漏，產(chǎn)生細(xì)菌脂質(zhì)體和細(xì)胞聚集簇[34]。2009年，Sitheeque 等[35]的電鏡掃描結(jié)果顯示：暴露于兒茶素和茶黃素的白色念珠菌表面呈現(xiàn)一種“桑果樣”褶皺狀態(tài)，傾向于細(xì)胞壁完全塌陷。2010年，Cho[36]發(fā)現(xiàn)經(jīng)茶多酚處理的口腔致病菌都表現(xiàn)出巨大的形態(tài)學(xué)變化，鏈球菌呈現(xiàn)不規(guī)則狀細(xì)胞聚集體。2012年，Cui 等[37]利用原子力顯微鏡圖像觀察到變形鏈球菌在1/8 MIC的EGCG 處理1 h 后變得起皺，表面粗糙度增加；在1/2 MIC 的EGCG 處理后細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)凸起，留下一些碎屑。2014年，Asahi 等[38]用電鏡直接觀察到EGCG 處理后的牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞膜損傷且細(xì)胞內(nèi)含物外泄。

多酚類物質(zhì)具有多種抗菌活性機(jī)制，包括與細(xì)菌蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相互作用，引起細(xì)胞質(zhì)膜損傷，降低膜流動(dòng)性，抑制核酸合成、細(xì)胞壁合成或能量代謝等[39]。Fathima 等[40]從誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）的角度闡釋了兒茶素破壞細(xì)菌細(xì)胞膜脂雙層及改變其通透性的抑菌機(jī)制。而關(guān)于細(xì)菌細(xì)胞壁的破壞，Cui 等[37]認(rèn)為EGCG 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的作用存在差異，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁聚集及損傷是通過(guò)與肽聚糖層直接結(jié)合，而其對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的破壞主要是由于H2O2的產(chǎn)生誘導(dǎo)。

2.3 抑制細(xì)菌產(chǎn)酸及產(chǎn)酸酶活性

口腔致病菌可通過(guò)代謝產(chǎn)生有毒終產(chǎn)物，如丁酸、丙酸、苯乙酸等，這些物質(zhì)分子質(zhì)量小，在較低濃度下便可破壞宿主細(xì)胞防御系統(tǒng)。2004年，Sakanaka 等[41]發(fā)現(xiàn)EGCG 可有效抑制卟啉單胞菌活力和產(chǎn)酸力，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL 時(shí)完全抑制苯乙酸的產(chǎn)生。陳秀蘭等[42]研究結(jié)果也顯示，EGCG 質(zhì)量濃度大于3.13 mg/L 時(shí)可抑制變形鏈球菌產(chǎn)酸。除兒茶素外，金恩惠等[43]發(fā)現(xiàn)茶黃素也抑制致齲菌（變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌）生長(zhǎng)和產(chǎn)酸并呈劑量效應(yīng)，并認(rèn)為茶黃素分子通過(guò)進(jìn)入細(xì)菌蛋白的“疏水口袋”來(lái)實(shí)現(xiàn)抑菌作用。

此外，2006年Hirasawa 等[44]研究揭示，EGCG還能通過(guò)抑制產(chǎn)酸酶，如乳酸脫氫酶（LDH）的活性來(lái)抑制酸分泌。2011年，Xu 等[45]發(fā) 現(xiàn)15.6～31.25 μg/mL 質(zhì)量濃度下的EGCG 通過(guò)抑制變形鏈球菌產(chǎn)生的F1Fo-ATP 酶活性來(lái)抑制其致病性。此外，變形鏈球菌分泌的3 種將牙表面蔗糖水解合成細(xì)胞外多糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶 （即GTFB，GTFC，GTFD）分別由gtfB，gtfC，gtfD 基因編碼[46]，而EGCG 在質(zhì)量濃度15.6 mg/mL 下可分別減少gtfB，gtfC，gtfD 基因表達(dá)量60.88%，60.49%和66.37%[32]。

2.4 抑制細(xì)菌促炎及相關(guān)基因表達(dá)

牙齦卟啉單胞菌是主要的牙周炎致病菌，脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，可以滲透牙齦結(jié)締組織，誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙周骨吸收[47]。牙齦卟啉單胞菌通過(guò)LPS 刺激MMPs mRNA 的表達(dá)，促使成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。Wen 等[48]的試驗(yàn)表明，添加5 mmol/L EGCG 后的1 mg/mL LPS 所增強(qiáng)的MMP-1 產(chǎn)生量顯著降低；此外，EGCG 也劑量依賴性減弱LPS 增強(qiáng)的IL-6 mRNA 的表達(dá)。有趣的是，Yun等[49]的試驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG 對(duì)單獨(dú)MMPs 的基因表達(dá)幾乎沒(méi)有影響，而對(duì)經(jīng)牙齦卟啉單胞菌刺激的成骨細(xì)胞衍生的MMP-2，MMP-9 和MMP-13的基因表達(dá)具有顯著的降低作用，最低抑制濃度僅為20 μmol/L。Kong 等[50]在其牙齦成纖維細(xì)胞侵染模型中發(fā)現(xiàn)茶黃素可以抑制牙齦卟啉單胞菌膠原酶對(duì)I 型膠原蛋白的降解活性，并通過(guò)抑制金屬蛋白酶MMP-1 和MMP-2 的表達(dá)和分泌來(lái)降低危害。類似地，Bedran 等[51]在菌體脂多糖誘導(dǎo)的炎癥模型中發(fā)現(xiàn)茶黃素還可以通過(guò)減少口腔表皮細(xì)胞白介素-8 分泌和增加抗菌肽hBD-1、hBD-2和hBD-4 分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)抗菌效果。

半胱氨酸蛋白酶包括Rgp 和Kgp 作為牙齦卟啉單胞菌分泌的重要毒力決定簇，可以引發(fā)巨噬細(xì)胞的促炎反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤壞死因子α（TNFα）和白細(xì)胞介素8（IL-8）的分泌[52]，其活性也受到兒茶素及其衍生物的抑制，測(cè)定的IC50值最低僅為3 μm[53]。Jade 等[54]證實(shí)了EGCG 是兒茶素類中抑制效果最佳的單體，其在質(zhì)量濃度62.5 mg/mL 時(shí)使RgpA 和Kgp 的表達(dá)量分別下降62.4%和51.6%，并認(rèn)為此種抑制是通過(guò)干擾細(xì)菌間群體反應(yīng)而進(jìn)行調(diào)節(jié)的。

2.5 抑制細(xì)菌產(chǎn)臭及產(chǎn)臭酶活性

具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌等致臭菌大量存在于患者牙周袋，代謝口腔中殘留的半胱氨酸，產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物。而兒茶素類單體物質(zhì)在2.5～25 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可抑制這類反應(yīng)[55]，EGCG 效果最佳，其在2 000 μg/mL 時(shí)減少具核梭桿菌刺激的H2S 產(chǎn)生量約72.5%[33]。此外，兒茶素還能抑制形成H2S 的關(guān)鍵酶活性，如牙齦卟啉單胞菌通過(guò)METase 酶促L-甲硫氨酸產(chǎn)生大量的甲硫醇并引發(fā)口臭，而31.25 μg/mL EGCG 可使METase 酶轉(zhuǎn)錄基因mg1 的表達(dá)量減少56%，在46.87 μg/mL 質(zhì)量濃度時(shí)也具有類似的下調(diào)作用并且抑制METase 蛋白表達(dá)55.2%[56]。Morin 等[57]研究證實(shí)EGCG 還能顯著降低Solobacterium moorei產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物的關(guān)鍵酶——β 半乳糖苷酶的基因表達(dá)。

一般認(rèn)為兒茶素類物質(zhì)抑制口腔致病菌的作用與結(jié)構(gòu)中的B 環(huán)沒(méi)食子?；虲 環(huán)的羥基化程度密切相關(guān)。EGCG 中連苯三酚 （3，4，5-三羥基） 結(jié)構(gòu)的存在增加了兒茶素的抗菌活性，這與Shahzad 等[58]對(duì)48 種多酚類物質(zhì)對(duì)牙周致病菌的研究結(jié)果一致。最近，Hui 等[59]研究證實(shí)茶黃素非競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)菌萜類合成途徑的第1 個(gè)限速酶1-脫氧木酮糖-5-磷酸異構(gòu)酶（DXR），分子模擬結(jié)果顯示茶黃素-3，3'-雙沒(méi)食子酸酯分子中的羥基與DXR 蛋白中的氨基酸殘基Lys36、Asp56、Glu339、Gln81、Val101 和Arg385 之間形成氫鍵和強(qiáng)作用力，該結(jié)果驗(yàn)證了Shahzad[60]認(rèn)為茶黃素的抑菌作用也來(lái)自于其酚性羥基的猜想。

3 茶藥理成分與其它天然成分、藥物聯(lián)合應(yīng)用

隨著茶藥理成分對(duì)口腔致病菌作用研究的深入，許多學(xué)者將一些天然成分與其聯(lián)用，以實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效的目的。2004年，黃曉晶等[60]將茶多酚與木糖醇聯(lián)用后抑制菌斑形成的效果與洗必泰相當(dāng)，顯著優(yōu)于兩種成分單獨(dú)使用時(shí)的效果，且具有良好的口感。2006年，Masuda[61]將紅茶提取物與異硫氰酸酯聯(lián)用后可顯著抑制變形鏈球菌的蔗糖依賴性粘附作用。2011年，盧國(guó)英[62]開(kāi)展了茶多酚與抗微生物制劑葡萄柚提取物（GSE）配伍使用來(lái)抑制變形鏈球菌致齲的研究，結(jié)果顯示：當(dāng)兩者質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL 和37.5 mg/L 時(shí)，能有效抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、分泌胞外多糖和粘附的能力。張微云等[63]研究結(jié)果顯示，將茶多酚與維生素C 混合使用可協(xié)同增效，顯著抑制牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)及口臭患者唾液細(xì)菌產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物，且治療效果接近臨床藥物氯己定。2016年，許秀秀等[64]發(fā)現(xiàn)茶多酚與檸檬提取物的聯(lián)用對(duì)變形鏈球菌的體外抗菌活性具有相加作用，并能降低菌體粘附力。此外，氯化鈉、有機(jī)酸類包括酒石酸、檸檬酸、EDTA 等均被報(bào)道與茶多酚聯(lián)用可增強(qiáng)抑菌效果[65-66]。上述與茶多酚聯(lián)用的天然成分，主要是在一定程度上保持了茶多酚的穩(wěn)定性，從而具有增效功能。

為降低醫(yī)療藥物的用量及其副作用，避免過(guò)度消費(fèi)抗生素導(dǎo)致的口腔超感染，在藥物中添加茶葉理化成分已成為疾病治療的常見(jiàn)方法。2011年，何松霖等[67]通過(guò)調(diào)整茶多酚和抗口臭成分鋅離子的體積比，可有效抑制牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和具核酸桿菌產(chǎn)生揮發(fā)性硫化物。楊暤等[68]結(jié)果顯示，茶多酚與抗菌藥物奧硝唑配伍使用，對(duì)牙周致病菌放線菌屬細(xì)菌的抑制作用加強(qiáng)，這為牙周藥物治療的臨床合理用藥提供了依據(jù)。Bedran 等[51]將甲硝唑與紅茶提取物及茶黃素聯(lián)用，Jade 等[54]將甲硝唑與綠茶提取物及EGCG 聯(lián)用，均對(duì)牙齦卟啉單胞菌具有顯著的抑制生長(zhǎng)和粘附作用，藥物間協(xié)同作用明顯，增強(qiáng)抗菌效果的同時(shí)降低甲硝唑使用濃度，減少對(duì)患者的不良反應(yīng)。

由此可見(jiàn)，茶多酚、茶黃素可與多種物質(zhì)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)更好的抑菌效果。這些研究提示茶藥理成分未來(lái)可在天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)和臨床藥物輔助等方面被進(jìn)一步挖掘和提升。

4 展望

上述體外研究提供的證據(jù)表明，茶葉藥理成分抗菌活性強(qiáng)，與抗生素及臨床藥物聯(lián)用可達(dá)到更有針對(duì)性的效果。將綠茶、白茶、花茶提取物及茶多酚添加于牙膏中，具有天然健康、綠色安全的優(yōu)勢(shì)。茶多酚以漱口液的產(chǎn)品形式，去除部分致臭菌和口腔殘留致臭底物，并抑制致齲菌、牙周致病菌的增長(zhǎng)，逐漸在日常生活中得到普及。深入開(kāi)發(fā)茶葉藥理成分并與其它抗菌劑聯(lián)用，研制出一系列安全、實(shí)用、有效的口腔?？飘a(chǎn)品，拓寬茶葉藥理成分在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，具有深遠(yuǎn)的意義。