徐忠燁,胡永珍,張立陽,李曉娜,李雪松
(惠州市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科,廣東 惠州 516002)
創(chuàng)傷性腦外傷常常引起神經(jīng)細胞大量的死亡和嚴重的神經(jīng)功能障礙,內(nèi)源性神經(jīng)干細胞不足以有效地重建損傷的結構和恢復神經(jīng)功能。因此,移植轉基因神經(jīng)干細胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷具有廣闊的應用前景,一方面其分泌的外源性細胞因子可以改善損傷局部的微環(huán)境為損傷組織提供營養(yǎng)支持;另一方面神經(jīng)干細胞可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)良好地整合,參與神經(jīng)結構的重建[1]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)是最為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,在促進神經(jīng)元存活和防止損傷后神經(jīng)細胞退行性病變等方面具有重要的作用[2-3]。本研究擬通過移植穩(wěn)定表達外源性hBDNF基因的神經(jīng)干細胞治療創(chuàng)傷性腦外傷大鼠,并探討可能的保護機制。
1.1 實驗材料細胞培養(yǎng)基和各種細胞因子為Sigma公司產(chǎn)品,RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品,TUNEL試劑盒為Roche公司產(chǎn)品。穩(wěn)定表達hBDNF和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的轉基因神經(jīng)干細胞為本實驗室自行制備及凍存, hBDNF ELISA檢測試劑盒為北京晶美公司產(chǎn)品。引物的設計與合成:hBDNF擴增上游引物為5'GACATCATTGGCTGACACTTTCG3',下游引物為5'ATGGGATTGCACTTGGTCTCGTA3',引物擴增產(chǎn)物長度為399bp;內(nèi)參基因GAPDH的擴增上游引物為5'GAAGGTCGGAGTCAACGG3',下游引物為5'GGAAGATGGTGATGGGATT3',引物擴增產(chǎn)物長度為221bp。
1.2 細胞的復蘇與擴增將凍存的細胞快速溶解后接種于含bFGF 20ng/mL,EGF 20ng/mL,1% N2和2% B27的DMEM/F12培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng),3~4d換液一次,7d傳代一次。移植前利用流式細胞儀檢測細胞表達EGFP的比率,利用RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)檢測轉基因神經(jīng)干細胞表達外源性hBDNF基因的情況,具體過程包括:由細胞或組織提取總RNA,與試劑盒中的DEPC H2O和Oligo(dT)混合后行逆轉錄反應獲得cDNA;取2μL cDNA與上下游引物、Taq酶、dNTP和PCR buffer混合至50μL總體積后進行PCR反應;反應產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,紫外線下觀察結果,并應用圖像分析系統(tǒng)分析結果。
1.3 動物模型制備成年雄性Wistar大鼠75只由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供,采用改進的Feeney’s自由落體硬膜外撞擊方法制備腦外傷大鼠模型,撞擊位置為右側前囟后3mm,中線旁2mm,將外傷后的大鼠分為3組(每組25只):Ⅰ組(對照組),注射PBS;Ⅱ組,移植神經(jīng)干細胞;Ⅲ組,移植轉基因神經(jīng)干細胞。具體移植方法和位置:外傷后24h,在傷側前囟后3mm和中線旁開1.1mm處分別在大腦皮層下2mm和4mm移植10μL PBS或細胞懸液(大約1×106個細胞),每點移植5μL。
1.4 轉基因細胞在體內(nèi)的存活及hBDNF的表達分別在移植后的1周和4周于各組隨機選取大鼠,取腦固定后,由注射點前后連續(xù)制備冰凍切片,切片厚20μm,并在共聚焦顯微鏡下觀察EGFP陽性細胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化。在移植后0d(傷后24h)、3d、1周、2周、3周和4周由各組中隨機選取大鼠,取損傷灶及周邊的腦組織200mg,應用RT-PCR和ELISA法檢測hBDNF在腦內(nèi)的表達。
1.5 各腦區(qū)細胞凋亡分析分別取移植后0d和移植后1周、2周、3周和4周的腦組織冰凍切片,應用TUNEL法檢測神經(jīng)細胞的凋亡。凋亡結果分析:取5張切片,在顯微鏡下觀察,定量計數(shù)每張切片內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)量。
1.6 神經(jīng)功能評分(Neurological Serverity Scores,NSS)移植細胞后0d、1周、2周、3周和4周,由每組動物隨機選取5只大鼠進行NSS評分,NSS評分包括運動功能、感覺功能、平衡能力和反射能力的測試,評分采用雙盲法。
1.7 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)以SPSS 18.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示,P<0.05為差異有顯著性。
2.1 細胞的復蘇和檢測凍存的神經(jīng)干細胞和轉基因神經(jīng)干細胞在復蘇后7d均可以形成細胞克隆,轉基因神經(jīng)干細胞表達EGFP(圖1),而非轉基因神經(jīng)干細胞無EGFP表達(圖2),將這些細胞克隆傳代2周后可見大量的神經(jīng)干細胞克隆形成(圖3、>4),應用流式細胞儀分析可見神經(jīng)干細胞基本無EGFP表達,而轉基因神經(jīng)干細胞接近百分百的表達EGFP(圖5)。RT-PCR分析表明(圖6),神經(jīng)干細胞無hBNDF基因表達,而轉基因神經(jīng)干細胞表達hBDNF基因。上述結果表明轉基因神經(jīng)干細胞經(jīng)過復蘇后仍可以穩(wěn)定地表達外源性基因,符合我們實驗的需要。
圖1 復蘇后EGFP陽性的轉基因神經(jīng)干細胞經(jīng)克隆(×200)
圖2 復蘇后的神經(jīng)干細胞克隆(×200)
圖3 轉基因神經(jīng)干細胞傳代后形成大量的
圖4 神經(jīng)干細胞傳代后形成大量的細胞克隆(×100)
圖5 FACS分析表明98.84%的轉基因神經(jīng)干細胞為EGFP陽性細胞,而神經(jīng)干細胞為EGFP陰性細胞
圖6 RT-PCR結果表明神經(jīng)干細胞不表達外源性的hBDNF基因,而轉基因神經(jīng)干細胞表達外源性的hBNDF基因
2.2 轉基因細胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化移植后1周和4周在激光共聚焦顯微鏡下均可以觀察到EGFP陽性細胞,移植后1周既可以觀察到一些細胞由移植點向損傷區(qū)域遷移,而4周后可以觀察到在病灶周邊有大量的EGFP陽性細胞,并表現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的形態(tài),具有明顯的軸突和樹突(圖7、圖8),說明移植細胞可以在宿主體內(nèi)長期存活、遷移及分化。
圖7 移植到體內(nèi)1周后可見EGFP陽性轉基因細胞的遷移(白色箭頭方向)。Scar=300μm
圖8 移植4周后,病灶周圍可見大量EGFP陽性轉基因細胞分化而來的具有明顯成熟神經(jīng)元形態(tài)的細胞(白色箭頭)。Scar=150μm
2.3 hBDNF在體內(nèi)的表達RT-PCR結果表明在移植后的較長時間內(nèi)(3d~4周),轉基因神經(jīng)干細胞可以持續(xù)性地表達外源性hBDNF基因,隨時間的推移表達水平有所下降,但是在4周后仍可見明顯的hBDNF表達(圖9)。
圖9 移植后損傷周邊區(qū)域內(nèi)外源性hBDNF mRNA表達的RT-PCR分析
注:1為對照組
ELISA檢測結果表明在移植后3d、1周、2周、3周和4周時,hBDNF在損傷局部的濃度分別是(4.24±0.52)、(5.12±0.63)、(3.4±0.73)、(3.22±0.58)、(2.56±0.45)ng/mg(總蛋白),變化趨勢基本與PR-PCR結果相同,說明轉基因神經(jīng)干細胞可以在較長時間內(nèi)分泌外源性的hBDNF。
2.4 細胞凋亡數(shù)量分析TUNEL檢測結果表明,外傷后24h打擊區(qū)域就有大量的細胞凋亡,各組間無明顯差異。在Ⅰ組與Ⅱ組中,損傷后1周凋亡數(shù)量最高,隨后凋亡數(shù)量下降,盡管在1周時Ⅱ組細胞凋亡數(shù)量少于Ⅰ組,但是無統(tǒng)計學差異,從2周以后Ⅱ組凋亡細胞數(shù)量開始明顯低于Ⅰ組。與Ⅱ組相比,Ⅲ組從移植1周后開始各時間點細胞凋亡數(shù)量明顯降低(P<0.05)。與Ⅰ組相比,Ⅲ組從移植1周后開始細胞凋亡數(shù)量降低更為明顯(P<0.01),如表1。
表1 病灶周邊細胞凋亡數(shù)量分析
注:在同一時間Ⅱ組與Ⅰ組比較,*P<0.05;Ⅲ組與Ⅰ組比較**P<0.01;Ⅲ組與Ⅱ組比較,#P<0.05。
2.5 大鼠神經(jīng)功能的影響各組大鼠外傷后24h NSS評分均較高,說明創(chuàng)傷性腦外傷造成大鼠嚴重的神經(jīng)功能障礙。Ⅱ組與Ⅰ組相比,從移植2周后開始NSS評分明顯降低(P<0.05);Ⅲ組和Ⅰ組相比,從移植1周后開始NSS評分明顯降低(P<0.01);Ⅲ組和Ⅱ組相比,從移植1周后開始NSS評分明顯降低(P<0.05),如表2。
表2 細胞移植后腦外傷大鼠的NSS評分
注:與Ⅰ組比較,*P<0.05;**P<0.01。與Ⅱ組比較,#P<0.05。
神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞,具有自我更新和向多種神經(jīng)細胞分化的潛能[4]。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)為移植外源性細胞替代各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的細胞損傷/壞死,促進神經(jīng)功能障礙的恢復開辟了一個新的領域[5]。此外,神經(jīng)干細胞還是一種優(yōu)秀的外源性基因載體,對于利用轉基因技術治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義[6]。
本研究結果表明,復蘇后的神經(jīng)干細胞和轉基因神經(jīng)干細胞可以在體外迅速地增殖,傳代后可以形成大量的細胞克隆,提示神經(jīng)干細胞和轉基因神經(jīng)干細胞經(jīng)過凍存和復蘇后其自我更新能力無明顯變化。為了追蹤外源性細胞在宿主體內(nèi)的存活、遷移和分化等,需要在細胞移植前對其進行合適的標記,現(xiàn)有的各種示蹤技術包括Brdu標記法、Hoechst標記法、轉染LacZ基因、轉染EGFP基因等方法[7]。在本研究中我們使用的轉基因神經(jīng)干細胞可以穩(wěn)定地表達EGFP,EGFP的熒光強度很高,作為報告基因容易被儀器定量檢測,并且在與目的基因連接后,可通過光學設備觀察和檢測外源性基因在細胞中的表達[8]。本研究的FACS結果表明轉基因神經(jīng)干細胞幾乎都可以表達EGFP,移植到大鼠腦內(nèi)后,這些轉基因神經(jīng)干細胞可以持續(xù)長時間地表達EGFP,這些EGFP充滿了細胞的胞體和突起。在移植1周時我們除了可以觀察到大量EGFP陽性細胞在宿主腦內(nèi)存活外,還可以發(fā)現(xiàn)由移植區(qū)域向損傷區(qū)域的“細胞遷移流”,這些細胞尚未到達損傷區(qū)域,在“細胞遷移流”中部分細胞可見分化出明顯的胞體和突起。移植4周后,我們?nèi)钥梢杂^察到大量的EGFP陽性細胞,部分細胞表現(xiàn)出成熟神經(jīng)細胞的形態(tài),具有典型的軸突和樹突。因此EGFP不僅可以用于示蹤細胞,便于我們研究細胞在體內(nèi)存活和遷移,還可以間接地反應出細胞分化狀態(tài)。
創(chuàng)傷性腦外傷除了造成嚴重的原發(fā)性損傷外,隨后發(fā)生的繼發(fā)性損傷將在一段時間內(nèi)持續(xù),在7d左右達到高峰,在損傷局部會出現(xiàn)的多種有害因素還可以通過旁觀者效應損傷與損傷灶相鄰的神經(jīng)組織或細胞,擴大神經(jīng)功能障礙[9-10]。在本研究中,TUNEL計數(shù)和NSS評分結果證明外傷后24h在各組大鼠損傷灶周邊即出現(xiàn)大量凋亡的神經(jīng)細胞,NSS評分在13~14分之間(NSS評分在13~18為重度損傷、7~12為中度損傷、1~6為輕度損傷),證明腦外傷大鼠產(chǎn)生了嚴重的神經(jīng)功能障礙。外傷后1周左右時在Ⅰ組和Ⅱ組中細胞凋亡達到高峰,NSS評分增加,而在Ⅲ組中細胞凋亡數(shù)量和NSS評分均下降。這些結果提示,原發(fā)性損傷后繼發(fā)性損傷可以加重神經(jīng)功能障礙,在1周左右時達到高峰,移植的神經(jīng)干細胞在1周時尚未發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護作用,這可能與此階段的移植細胞正在向損傷區(qū)域遷移,尚未參與損傷的重建和神經(jīng)的保護作用,而轉基因神經(jīng)干細胞則在移植后1周時就可以發(fā)揮了神經(jīng)保護作用,這可能與其分泌的hBDNF參與了神經(jīng)保護作用有關。
神經(jīng)細胞的存活和生長離不開多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激,在病理情況下施加外源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子會明顯地促進神經(jīng)細胞存活和再生,改善宿主的神經(jīng)功能障礙。因為繼發(fā)性損傷將在較長的一段時間內(nèi)存在,因此只有移植穩(wěn)定表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的外源性細胞才能確實有效地產(chǎn)生保護作用[11]。BDNF在促進成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活和防止損傷后神經(jīng)細胞退行性病變等方面具有重要的作用[12],然而在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其含量極微,盡管在損傷后有一過性的表達增加,但維持時間較短,并且血腦屏障阻礙了從循環(huán)途徑應用的BDNF,因此極大地限制了BDNF在治療中的應用[13]。為了解決上述問題,我們在前期工作中制備了可以穩(wěn)定表達hBNDF的轉基因神經(jīng)干細胞。在本研究中,RT-PCR檢測證實復蘇的轉基因神經(jīng)干細胞,擴增后仍可以表達hBDNF,移植后,腦組織的RT-PCR和ELISA檢測表明這些轉基因神經(jīng)干細胞在體內(nèi)可以長期地表達hBDNF,將損傷局部的hBDNF維持在較高水平。TUNEL和NSS評分結果顯示,在細胞移植1周后,與Ⅱ組大鼠相比,Ⅲ組大鼠損傷病灶周邊的細胞凋亡數(shù)量明顯下降,NSS評分也明顯下降,說明轉基因神經(jīng)干細胞分泌的hBDNF對病灶周圍的神經(jīng)細胞產(chǎn)生了明確的保護作用,進而促進了大鼠神經(jīng)功能障礙的恢復。
總之,我們的研究表明,hBDNF轉基因神經(jīng)干細胞可以在體內(nèi)長期、存活及分化,分泌的hBDNF可以直接作用于神經(jīng)細胞產(chǎn)生明確的保護作用,促進腦外傷大鼠神經(jīng)功能的恢復。本研究的成功將為進一步利用轉基因神經(jīng)干細胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病/損傷奠定一定的理論和實踐基礎。