李傳靈，石曉晴，黃月英，卞 俊*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院虹口分院藥學(xué)科，上海 200434；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，南昌 330004)

1 儀器和試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Nano-Zs90 粒徑分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)；80-1離心機(jī)(上海手術(shù)機(jī)械廠)；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；JY92-2D細(xì)胞超聲破碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SK3300H超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑和藥品 卵磷脂[磷脂酰膽堿(PC)≥98%，批號(hào)201608011]、膽固醇(批號(hào)D1605010，阿拉丁試劑有限公司)；注射用大豆磷脂、口服大豆磷脂(PC≥85%，上海太偉藥業(yè)有限公司)；葉黃素(批號(hào)20170331，浙江海寧鳳鳴葉綠素有限公司)；吐溫-80(批號(hào)101720160801，湖南爾康制藥股份有限公司)；乙腈(色譜純，批號(hào)R141464，迪馬科技有限公司)；氯仿(分析純，批號(hào)20170626，常熟市楊園化工有限公司)；Sephadex G-50(批號(hào)170313，上海金穗生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液、注射用水(海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院虹口院區(qū)藥學(xué)科自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 葉黃素脂質(zhì)體的制備 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定葉黃素脂質(zhì)體的制備工藝為：精密稱取處方量磷脂、膽固醇、葉黃素和少量的吐溫-80，置于250 ml圓底燒瓶中，加入氯仿，于水浴中超聲加速溶解。將圓底燒瓶置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，抽真空，旋蒸除去氯仿，在圓底燒瓶上形成均勻薄膜，用磷酸鹽緩沖液水化，將類脂膜洗脫并水合成脂質(zhì)體初懸液，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲，再經(jīng)過0.45、0.22 μm微孔濾膜各過濾3次，得到脂質(zhì)體懸浮液，于4 ℃下保存。

2.2 脂質(zhì)體中葉黃素分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 DiamonsilC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：100%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：443 nm；流速：0.6 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。在該色譜條件下，葉黃素峰的理論塔板數(shù)≥10 000，分離度>1.5。

2.2.2 包封率的測(cè)定[9]包封率(EE)是指包封在脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量占投入總藥量的百分比，是脂質(zhì)體制劑處方篩選和建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)。用公式表示：EE(%)=wdrug/wtot×100%,其中wdrug表示包封在脂質(zhì)體中的藥物量，wtot表示脂質(zhì)體混懸液中的藥物總量。

2.2.3 凝膠微柱的制備 稱取 Sephadex G-50約5 g，加入蒸餾水100 ml，于80 ℃溶脹3 h，室溫過夜使完全溶脹。裝填于5 ml注射器中待水自然流下,用pH為7.0的磷酸鹽緩沖液洗脫2～3個(gè)柱床體積,飽和后的凝膠微柱約5 cm,將裝好的微柱置于離心機(jī),2×103×g離心3 min，使凝膠柱失水皺縮,備用。

在影片中，還有一場(chǎng)戲，是黃覺和湯唯飾演的男女主人公要逃亡，兩人身處險(xiǎn)境，像到了末日的感覺。劇組開著車，出去找這場(chǎng)戲的景。他們到了一個(gè)地方，看到一條鐵路，沿著鐵路往前走，在鐵路旁邊發(fā)現(xiàn)了一棟房子，覺得它就是合適的拍攝場(chǎng)地?；疖嚱?jīng)過時(shí)，這棟房子里面會(huì)很吵。畢贛最初的設(shè)想是，火車經(jīng)過，屋子里的燈和其他很多道具會(huì)晃動(dòng)起來，制造一種末日的感覺。但到了拍攝時(shí)，他跟主創(chuàng)交流后發(fā)現(xiàn)，之前設(shè)想的那些意象很難實(shí)現(xiàn)，也并沒有他想象中的那樣文學(xué)化。于是最后選擇了一個(gè)道具，就是在桌上晃動(dòng)的一個(gè)杯子，來表現(xiàn)那種末日感。

2.2.4 游離藥物的分離 精密量取2.1項(xiàng)下的脂質(zhì)體懸浮液 0.2 ml，上樣于自制的凝膠微柱的頂端，平行操作3份，1.5×103×g離心1 min，收集離心液。加入pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液0.4 ml于凝膠微柱的頂端，1.5×103×g離心2 min，分別連續(xù)操作2次，合并3次收集的離心液，置于2 ml量瓶中，用甲醇破乳并定容，計(jì)算包封率。

2.2.5 粒徑的測(cè)定 取經(jīng)過凝膠微柱分離的葉黃素脂質(zhì)體1 ml，置于納米粒徑分析儀中，測(cè)定葉黃素脂質(zhì)體的粒徑分布。

2.2.6 滲漏率的測(cè)定 將不同制備條件得到的葉黃素脂質(zhì)體于4 ℃下儲(chǔ)藏15 d,每隔一段時(shí)間取樣,測(cè)定葉黃素脂質(zhì)體的包封率，并計(jì)算滲漏率。脂質(zhì)體滲漏率的計(jì)算公式為：滲漏率=(EE儲(chǔ)存過程中/EE開始時(shí))×100%。

2.3 處方和工藝篩選及星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方和工藝 采用單因素試驗(yàn)，固定其他的量不變，改變其中一種試驗(yàn)因素，按照2.1項(xiàng)下方法制備葉黃素脂質(zhì)體，以葉黃素包封率(EE)和粒徑(l)為指標(biāo)，分別考察磷脂種類、磷脂與膽固醇質(zhì)量比(膜材比)、吐溫用量、葉黃素用量(載藥量)、緩沖液pH、吐溫-80加入順序、旋蒸溫度、超聲功率對(duì)指標(biāo)的影響，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選對(duì)指標(biāo)影響較大的因素，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方和工藝。

2.3.1 單因素試驗(yàn)

2.3.1.1 磷脂種類 固定其他因素不變，只改變磷脂的種類，分別用卵磷脂、口服大豆磷脂和注射用大豆磷脂，按照2.1項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，考察其對(duì)包封率和粒徑的影響。結(jié)果顯示，包封率注射用大豆磷脂>卵磷脂>口服大豆磷脂，而粒徑注射用大豆磷脂<口服大豆磷脂<卵磷脂，并且3種磷脂制備的脂質(zhì)體在保存10 d后，卵磷脂脂質(zhì)體產(chǎn)生了明顯絮凝沉淀。注射用大豆磷脂制備的脂質(zhì)體包封率和粒徑優(yōu)于口服大豆磷脂，因此選擇注射用大豆磷脂制備脂質(zhì)體。

2.3.1.2 膜材比 固定其他因素不變，只改變膜材比，設(shè)定磷脂與膽固醇質(zhì)量比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1，按照2.1項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，考察其對(duì)包封率和粒徑的影響，結(jié)果見圖1A。脂質(zhì)體混懸液中總投藥量不變，隨著膽固醇含量的減少，脂質(zhì)體包封率先增大后降低， 當(dāng)磷脂與膽固醇的比例為 5∶1 時(shí)，圓底燒瓶上有部分葉黃素脂質(zhì)體沒有水化，此時(shí)包封率最低，為 16.87%，原因可能是因?yàn)槟懝檀嫉臐舛容^高時(shí)，脂質(zhì)體剛性太大，超出了膜負(fù)荷，所形成的磷脂雙分子層不穩(wěn)定，造成部分脂質(zhì)體破裂。當(dāng)磷脂濃度過高時(shí)，磷脂與藥物易形成單獨(dú)的磷脂復(fù)合物，從而使脂質(zhì)體的包封率降低。由圖1A可知，膽固醇和磷脂質(zhì)量比在10∶1～20∶1范圍內(nèi)，脂質(zhì)體的包封率較高，而且粒徑較小，因此選擇10∶1～20∶1范圍繼續(xù)考察。

圖1 粒徑和包封率的單因素試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Results of single factor test on particle size and entrapment efficiencyA:膜材比考察結(jié)果；B:葉黃素用量考察結(jié)果；C:旋蒸溫度考察結(jié)果；○：包封率；●：粒徑

2.3.1.3 吐溫-80用量 固定其他因素不變，只改變吐溫-80的用量，分別用0.25%、0.5%、0.75%和1% 4種濃度的吐溫-80，按照2.1項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，考察其對(duì)包封率和粒徑的影響。結(jié)果表明，吐溫-80在一定程度上可以提高葉黃素脂質(zhì)體的包封率并減小粒徑，吐溫-80用量為0.75%時(shí)制備的脂質(zhì)體粒徑最小，包封率達(dá)到要求。過多的吐溫-80會(huì)加速脂質(zhì)體的聚集，從而降低其包封率并使粒徑增大，因此吐溫-80用量最佳為0.75%。

2.3.1.4 葉黃素用量 固定其他因素不變，只改變?nèi)~黃素用量(載藥量)，分別添加葉黃素原料藥5、6.5、8、9.5、11 mg，按照2.1項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，考察其對(duì)包封率和粒徑的影響，結(jié)果見圖1B。在葉黃素加入量<8 mg時(shí)，其包封率和粒徑都隨載藥量增加而增大，當(dāng)其加入量>8 mg時(shí)，包封率隨之降低，而粒徑則先減小后增大，為保證增加包封率的同時(shí)減小粒徑，選擇葉黃素用量5～8 mg范圍繼續(xù)考察。

2.3.1.5 緩沖液pH值 固定其他因素不變，只改變緩沖液pH值，分別使用pH值為6.5、6.8、7.0、7.2和7.4的5種緩沖液，按照2.1項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，考察其對(duì)包封率和粒徑的影響。結(jié)果表明，在緩沖液pH值為6.5～7.0時(shí)，包封率和粒徑不存在最優(yōu)值；pH值在7.0～7.4時(shí)，pH值主要影響脂質(zhì)體的包封率，對(duì)粒徑影響較?。划?dāng)pH值為7.0時(shí)，其包封率最佳，并且粒徑最小，因此選擇緩沖液pH值為7.0。

2.3.1.6 旋蒸溫度 固定其他因素不變，只改變旋蒸溫度，按照2.1項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，分別考察30、40、50和60 ℃對(duì)包封率和粒徑的影響，結(jié)果見圖1C。在30～40 ℃，葉黃素脂質(zhì)體的包封率和粒徑隨溫度升高而增加；40～50 ℃時(shí)包封率和粒徑隨溫度升高而減小，但包封率均在80%以上，粒徑均<80 nm。50～60 ℃時(shí)包封率<80%，粒徑>80 nm。在30～50 ℃旋蒸溫度范圍內(nèi)包封率和粒徑最佳，因此選擇旋蒸溫度為30～50 ℃繼續(xù)考察。

2.3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.3.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取葉黃素用量(X1)、膜材比(X2)和旋蒸溫度(X3)3個(gè)對(duì)指標(biāo)影響較大的因素，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化。葉黃素用量(X1)取值范圍為5～8 mg，膜材比(X2)取值范圍為10∶1～20∶1，旋蒸溫度取值范圍(X3)為30～50 ℃。以包封率(Y1)、粒徑(Y2)和滲漏率(Y3)為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化葉黃素脂質(zhì)體制備工藝參數(shù)。采用 Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行 3 因素 3 水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，結(jié)果見表2。

2.3.2.2 模型擬合和效應(yīng)面優(yōu)化 采用 Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到自變量對(duì)響應(yīng)值影響的回歸方程、三維效應(yīng)面圖和二維等高線圖，見圖2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的因素水平表Table 1 The factors and levels of central composite design-response surface method

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的結(jié)果Table 2 Results of central composite design-response surface method (n=3)

回歸方程：Y1=86.38-3.74X1+1.43X2-1.23X3+0.01X1X2+1.09X1X3+0.59X2X3-3.37X12-2.34X22-1.01X32;Y2=71.48-0.081X1-0.47X2+1.70X3+0.15X1X2-0.38X1X3+2.01X2X3+0.25X12+2.88X22+4.74X32;Y3=-18.11+1.63X1+3.12X2+3.43X3。

結(jié)果表明，Y1、Y2的二項(xiàng)式擬合效果好，而Y3的線性擬合效果較好。從圖2可見，膜材比、旋蒸溫度和葉黃素用量對(duì)藥物的包封率有顯著影響，旋蒸溫度和膜材比對(duì)粒徑的影響較大，葉黃素用量對(duì)粒徑影響不顯著。

2.3.2.3 葉黃素脂質(zhì)體最優(yōu)處方及其制備工藝的確立 根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，篩選確定制備脂質(zhì)體的最優(yōu)處方：葉黃素用量為5.34 mg，膜材比為14.35∶1，旋蒸溫度為32.9 ℃。最終優(yōu)化制備工藝：先稱取處方量的注射用大豆磷脂及膽固醇置于250 ml圓底燒瓶，再加入15 ml氯仿及少量吐溫-80，超聲溶解后，置于32.9 ℃恒溫水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去有機(jī)溶劑，得到在瓶壁形成的均勻磷脂膜；放冷至室溫后，加入20 ml 磷酸鹽緩沖液，置40 ℃恒溫水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中水化1 h，得到葉黃素脂質(zhì)體初混懸液，將初混懸液置于超聲破碎機(jī)中超聲(功率400 W)，再經(jīng)過0.45、0.22 μm微孔濾膜各過濾3次，得到脂質(zhì)體混懸液，于4 ℃下保存。

2.3.2.4 最優(yōu)處方和驗(yàn)證 根據(jù)篩選出的最優(yōu)化條件制備脂質(zhì)體，重復(fù)3次,測(cè)定脂質(zhì)體包封率、粒徑和滲漏率，根據(jù)測(cè)量結(jié)果，驗(yàn)證最優(yōu)處方和工藝，結(jié)果見表3。

由表3可見，包封率、粒徑和滲漏率與星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，3個(gè)指標(biāo)的偏差均<10%，表明該方案重復(fù)性好，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法篩選出的結(jié)果為最優(yōu)方案。

表3 優(yōu)選工藝驗(yàn)證結(jié)果
Table 3 Verification results of the optimal technology

包封率(EE/%)粒徑(l/nm)滲漏率(%)預(yù)測(cè)值88.51±0.3072.94±0.1016.07±0.20實(shí)際值87.49±0.3368.52±0.2114.54±0.50偏差(%)1.156.069.52

3 討 論

3.1 分離方法 本研究中葉黃素為脂溶性藥物，不溶于水，遇光熱易分解。為了減小誤差，應(yīng)選擇可以快速分離被包藥物與游離藥物的方法。因此，本研究共考察了有機(jī)溶劑萃取法[10]、微型柱離心法和超濾法[11]3種快速分離方法。結(jié)果超濾法不適合葉黃素藥物的包封率測(cè)定，因?yàn)槿~黃素的脂溶性強(qiáng),未包封的藥物在外水相的溶解度低,會(huì)以小晶體的形式存在,同樣被超濾膜截流在上層,超濾液中的游離藥物很少,造成包封率結(jié)果偏高，分離度只有14.81%左右。石油醚萃取法同樣不適合葉黃素脂質(zhì)體的分離，因葉黃素在石油醚中的溶解度很低，分離度只有89.61%左右，且石油醚具有強(qiáng)刺激性，不利于制備成制劑。利用葡聚糖凝膠微型柱測(cè)定脂質(zhì)體包封率,不僅洗脫速度快,而且可以有效分離游離藥物，分離度>98%，故本研究采用微型柱離心法。

3.2 制備方法 脂質(zhì)體的制備方法有多種，其中薄膜分散-超聲法所需設(shè)備、儀器條件和操作較為簡(jiǎn)單，且使用的主藥和磷脂等輔料較少，費(fèi)用較低，且葉黃素是脂溶性、弱堿性的結(jié)晶藥物，因此本研究選擇薄膜分散超聲法作為制備方法。

圖2 各因素對(duì)包封率、粒徑和滲漏率影響的等高線圖及效應(yīng)面圖Figure 2 Contour lines and response surface graphs of each influential factors on entrapment efficiency,particle size and leakage rateA、B、C、D、E、F:包封率的等高線及響應(yīng)面圖；G、H、I、J、K、L:粒徑的等高線及響應(yīng)面圖；M、N:滲漏率的等高線及響應(yīng)面圖

3.3 吐溫-80加入順序及超聲功率 單因素試驗(yàn)中，考察了吐溫-80加入順序和超聲功率對(duì)包封率和粒徑的影響。結(jié)果表明吐溫-80的加入順序?qū)Π饴视绊戄^小，但是水化時(shí)加入吐溫-80比水化前加入更容易引起葉黃素脂質(zhì)體聚集，而且葉黃素脂質(zhì)體的粒徑更大，因此選擇在水化前加入吐溫-80。在超聲功率200～800 W范圍內(nèi)，400 W時(shí)包封率和粒徑為最優(yōu)值，因此選擇超聲功率400 W。