蔣永升，沈洋，楊敏威，陶泠燁，何睿哲，孫勇偉

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院 膽胰外科，上海 200127）

據(jù)相關(guān)報道，在其他腫瘤預(yù)后顯著提高的背景下，從1971年至2011年這四十年間胰腺癌患者的預(yù)后卻幾乎沒有任何改善[1-4]。多種生物學(xué)特征造成了這一結(jié)果，有氧糖酵解在其中最為突出。相較于氧化磷酸化過程，腫瘤更傾向于利用糖酵解的方式獲取能量，即有氧糖酵解[5]，也被稱為瓦伯格效應(yīng)（Warburg effect）[6]。根據(jù)Bailey、Collisson基于表達(dá)譜水平提出的胰腺癌分型標(biāo)準(zhǔn)[7]，預(yù)后最差的準(zhǔn)間質(zhì)亞組（quasimesenchymal subtype）也表現(xiàn)出顯著增強的糖酵解活動[8]。因此，近年來大量的研究聚焦于細(xì)胞糖酵解對胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞糖酵解處于癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也指出針對腫瘤細(xì)胞糖代謝異常的治療方法可能是胰腺癌治療的關(guān)鍵[9-12]。

本研究中，我們旨在尋找影響胰腺癌有氧糖酵解的新分子機制，增加對胰腺癌的認(rèn)識與了解，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點。G蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptors，GPCRs）是人體內(nèi)最大的跨膜受體家族，在細(xì)胞信號傳遞中發(fā)揮著重要的作用[13]。近年來針對G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A基因（GPRC5A）的研究發(fā)現(xiàn)，其對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等細(xì)胞功能均存在影響，并且在結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均存在異常高表達(dá)[14]，但針對其在胰腺癌中的研究卻鮮有報道，因而本研究擬分析GPRC5A在胰腺癌臨床樣本中的表達(dá)情況及其對胰腺癌細(xì)胞有氧糖酵解的影響。

1 材料和方法

1.1 表達(dá)譜芯片組織樣本

本課題中所用建立表達(dá)譜芯片的原始樣本為50對上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院膽胰外科2012年1月至2013年12月期間手術(shù)治療并通過術(shù)后病理確診的胰腺癌患者的胰腺癌組織與癌旁組織。本表達(dá)譜芯片所有患者組織及臨床資料的收集與使用均通過上海交通大學(xué)附屬仁濟醫(yī)院倫理審查委員會的審核與批準(zhǔn)。

1.2 生物信息學(xué)分析資料

本課題所用的TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺導(dǎo)管腺癌的mRNA測序數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫，GTEx正常胰腺mRNA測序數(shù)據(jù)下載自GTEx數(shù)據(jù)庫，GSE16515和GSE28735的mRNA數(shù)據(jù)下載于GEO數(shù)據(jù)庫?；蚋患治鼋Y(jié)果通過GSEA軟件分析Hallmarks數(shù)據(jù)集所得。

1.3 胰腺癌細(xì)胞系的復(fù)蘇培養(yǎng)與干擾GPRC5A表達(dá)

本研究所用細(xì)胞均購自上海中科院，在含有10% FBS（美國Gibco公司）和雙抗的1640培養(yǎng)基（上海源培生物科技有限公司）或DMEM培養(yǎng)基（上海源培生物科技有限公司）中培養(yǎng)，孵育箱設(shè)置條件為37 ℃、5% CO2。

進(jìn)行小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染前，將對數(shù)生長期胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)，每孔細(xì)胞生長至60%左右，換液，將siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）與Lipofectamine 2000（賽默飛公司）混勻加入配液中，6～8 h后換液，轉(zhuǎn)染48 h后檢測干擾效率。干擾序列：siGPRC5A-1：5’-AGGCAGCAUUUUUCGCC UGTT-3’；siGPRC5A-2：5’-GCTTATGTTAGTCCCG AGTTT-3'。

1.4 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、Real-time PCR檢測

步驟參考文獻(xiàn)[15]。

1.5 Seahorse糖酵解能力測定

為測定細(xì)胞的代謝方式與代謝強度，我們利用XF 96 Seahorse分析儀檢測細(xì)胞的細(xì)胞外酸化程度（ECAR），以5 000～20 000/孔的密度將細(xì)胞種到XF96孔板中，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細(xì)胞貼壁，為測定ECAR值，順次向培養(yǎng)皿中加入葡萄糖、寡霉素和2-DG，待機器讀數(shù)完成后分析數(shù)據(jù)結(jié)果。詳細(xì)操作過程參考文獻(xiàn)[15]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較使用t檢驗或者卡方分析，Kaplan-Meier法進(jìn)行預(yù)后分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPRC5A的篩選過程

為了篩選出胰腺癌中與糖酵解相關(guān)性高的癌基因，我們設(shè)定篩選條件：（1）在課題組50對表達(dá)譜芯片（仁濟表達(dá)譜芯片）中癌與癌旁組織具有統(tǒng)計學(xué)差異性表達(dá)（P＜1×10-5）；（2）在仁濟表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)中與糖酵解相關(guān)基因的相關(guān)性排名前10%；（3）在The Cancer Genome Atlas（TCGA）胰腺癌數(shù)據(jù)庫中與糖酵解相關(guān)基因的相關(guān)性排名前10%；（4）屬于Collisson的胰腺癌分型中預(yù)后最差的一組——準(zhǔn)間質(zhì)亞組（quasimesenchymal subtype）的標(biāo)志性基因[7]。經(jīng)過篩選，我們最終得到包括GPRC5A在內(nèi)的七個基因（GPRC5A、HMMR、SLC5A3、SLC16A1、TWIST1、PMAIP1、NT5E），其中并未發(fā)現(xiàn)關(guān)于GPRC5A在胰腺癌有氧糖酵解影響的報道，因此，本研究中我們選取GPRC5A做進(jìn)一步的研究與機制探討（圖1A）。

2.2 GPRC5A在臨床數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)情況

我們首先從Gene Expression Omnibus（GEO）公共數(shù)據(jù)庫中下載了GSE15471、GSE16515、GSE28735三個公共數(shù)據(jù)集并結(jié)合課題組50對表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，并分別在三個數(shù)據(jù)庫中比較了腫瘤與癌旁組織中GPRC5A的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPRC5AmRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平均高于癌旁組織（GSE15471，P＜0.0001；GSE16515，P=0.0157；GSE28735，P＜0.0001） （圖1B）。我們接著比較了GPRC5A在TCGA的腫瘤樣本與The Genotype-Tissue Expression（GTEx）中的正常樣本中的表達(dá)情況，結(jié)果同樣顯示GPRC5A在腫瘤樣本中表達(dá)量更高（圖1C） （P=0.0311），為判斷GPRC5A表達(dá)量對胰腺癌預(yù)后的影響，我們將179例TCGA胰腺癌標(biāo)本根據(jù)GPRC5A表達(dá)量高低分為兩組，并對兩組患者的預(yù)后進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示高表達(dá)GPRC5A的患者無論是總生存期（P=0.0069）還是無進(jìn)展生存期（P=0.02）均顯著短于GPRC5A低表達(dá)組（圖1D），以上結(jié)果提示我們GPRC5A在胰腺癌中高表達(dá)，其高表達(dá)預(yù)示著患者具有較差的預(yù)后。

2.3 GPRC5A促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解

圖1 糖酵解相關(guān)基因篩選及GPRC5A的表達(dá)與預(yù)后分析

由于GPRC5A是通過根據(jù)與糖酵解相關(guān)基因的相關(guān)性篩選得到的，我們推測其是否通過影響胰腺癌細(xì)胞的糖酵解能力進(jìn)而發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤生長的作用。首先，我們把測序得到的50對表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)根據(jù)GPRC5A的表達(dá)情況分為高、低表達(dá)兩組，并進(jìn)行了基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），結(jié)果提示糖酵解數(shù)據(jù)集在GPRC5A高表達(dá)組中存在富集（圖2A）。另外我們還分析了表達(dá)譜芯片中GPRC5A同糖酵解關(guān)鍵酶的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其與絕大部分的關(guān)鍵酶均存在較高的正相關(guān)性（圖2B）。我們接下來測定了不同胰腺癌細(xì)胞系中GPRC5A的表達(dá)情況，并選擇其中表達(dá)量較高的AsPC-1和BxPC-3進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞功能實驗（圖2C），通過siRNA在兩個細(xì)胞系中對GPRC5A的表達(dá)進(jìn)行干擾并通過實時定量PCR進(jìn)行效率驗證（圖2D）。隨后，我們通過Seahorse檢測儀檢測了正常與GPRC5A干擾的細(xì)胞中細(xì)胞外酸化程度（ECAR），結(jié)果顯示兩個細(xì)胞系中GPRC5A敲低組的ECAR值均顯著低于對照組（圖2E），提示干擾GPRC5A后腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力出現(xiàn)減弱。

圖2 GPRC5A對胰腺癌細(xì)胞糖酵解能力的影響

3 討論

糖酵解作為腫瘤的重要特征之一，在胰腺癌中具有更為重要的意義，原因在于胰腺癌的一個重要特征是其具有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)成分，這導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)乏氧、乏血供的腫瘤微環(huán)境，在這種條件下腫瘤更加依賴不耗氧的糖酵解獲取能量[16]。通過糖酵解細(xì)胞能更快地獲取能量，滿足其對能量的快速需求。另外，腫瘤細(xì)胞增殖復(fù)制需要大量的核苷酸、氨基酸等生物大分子及前體物質(zhì)，而糖酵解產(chǎn)生的中間產(chǎn)物則能很好地對其合成代謝進(jìn)行原料的補充，這也是器官發(fā)育過程中干細(xì)胞的主要代謝特點。

在本研究中，我們首先通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了GPRC5A可能對胰腺癌糖酵解過程存在促進(jìn)作用，一方面，我們利用TCGA、GEO等數(shù)據(jù)庫證實GPRC5A在胰腺癌組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組織，同時其高表達(dá)預(yù)示著較差的預(yù)后，另外我們也通過GSEA數(shù)據(jù)分析、Seahorse糖酵解實驗證實了我們的猜想。

G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A（GPRC5A）屬于人體內(nèi)最大的蛋白超家族G蛋白偶聯(lián)受體，包含有超過700個基因，這一家族在多種生物學(xué)過程中均發(fā)揮了重要的功能，也經(jīng)常被利用為藥物作用靶點。G蛋白偶聯(lián)受體在腫瘤進(jìn)展中也發(fā)揮了不可或缺的作用，因此進(jìn)一步研究這一家族在胰腺癌中的作用具有重要意義，GPRC5A基因在在多種腫瘤中均有報道，但其發(fā)揮的功能不盡相同，在乳腺癌中GPRC5A高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[17]，而在肺腺癌中GPRC5A則被認(rèn)為是抑癌基因，在GPRC5A敲除的小鼠中有76%的小鼠出現(xiàn)了肺腺瘤，17%的小鼠出現(xiàn)了肺腺癌[18]。

綜上所述，在本次研究中我們揭示了GPRC5A在胰腺癌中對糖酵解的促進(jìn)作用，存在著作為治療靶點的潛力，但其發(fā)揮功能的具體機制還有待進(jìn)一步闡明。