李明學(xué),王文廣,李娜,匡德宣,仝品芬,黃鑫,2,黎曉慧,孫曉梅*,陸彩霞*
(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心,昆明 650118; 2. 昆明醫(yī)科大學(xué),昆明 650500)
早老素-1(presenilin 1,PSEN1)是一種早老素蛋白,在人類中由位于染色體14q24.2的PSEN1基因編碼,屬于進(jìn)化保守基因家族成員[1-2]。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)PSEN1是構(gòu)成γ-分泌酶中四種核心蛋白之一[3],γ-分泌酶與β-分泌酶二者共同作用連續(xù)分解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白(Aβ)[4-5]。β-淀粉樣蛋白(Aβ)累積是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)一個(gè)重要病理特征[6-7]。相關(guān)的研究結(jié)果已明確表明PSEN1、PSEN2和APP是AD的致病基因[1]。PSEN1 作為構(gòu)成γ-分泌酶的核心蛋白之一不僅在AD發(fā)病中起重要作用,而且在信號(hào)通路中亦起著關(guān)鍵作用。據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道PSEN1蛋白可以影響Wnt信號(hào)通路,能與β-連環(huán)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,使其不被降解。而在Notch信號(hào)通路中,由于PSEN1在蛋白水解過(guò)程中起重要作用,從而影響Notch受體的成熟和活化[9]。
樹鼩(Tupaiabelangerichinensis)是一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,其生理、生化、解剖結(jié)構(gòu)以及基因組等生物學(xué)特性比嚙齒類更接近于非人靈長(zhǎng)類,已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中。Yamashita 等[10]在正常年老的樹鼩大腦中檢測(cè)到Aβ累積這一重要的病理特征。Fan等[6]分析樹鼩腦組織中與AD相關(guān)131個(gè)基因,并與人、獼猴和小鼠進(jìn)行同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)樹鼩與人類AD基因的序列同源性高于小鼠,而且樹鼩腦組織中Aβ累積與NFTs的表達(dá)模式與人類腦組織相似,具有類似的年齡依賴效應(yīng)。這些研究提示樹鼩可以作為一個(gè)潛在的AD動(dòng)物模型。
本研究以確定樹鼩PSEN1完整編碼序列為目的,對(duì)其進(jìn)行分子特征和組織表達(dá)量分析,為今后制備樹鼩PSEN1單克隆抗體、研究其在樹鼩AD模型中Aβ累積機(jī)理及癌癥研究中奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
采用本實(shí)驗(yàn)室繁育的普通級(jí)中緬樹鼩3只,體重160~200 g,2~3歲,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供【SCXK(滇)K2018-0002】。實(shí)驗(yàn)操作在本中心實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK(滇)K2018-0002】,并遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R和福利倫理原則。
采用過(guò)量戊巴比妥鈉給予樹鼩安樂(lè)死后,迅速解剖樹鼩,并取心臟、肝、脾、肺、腎、胰、腦和肌肉等組織,立即放入-80℃冰箱,冷凍儲(chǔ)存。
1.1.2 試劑與儀器
柱式TRIzol總RNA提取試劑盒(B511321,生工,中國(guó));M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit M-MuLV試劑盒(B532435,生工,中國(guó));Ex Taq? Hot Start Version試劑盒(RR006 A,TaKaRa,日本);One Step TB GreenTMPrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)(RR096 A,TaKaRa,日本);柱式膠回收試劑盒(B518131,生工,中國(guó));PMSF(ST506,碧云天,中國(guó));蛋白裂解液(P0013,碧云天,中國(guó)); BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(P0010,碧云天,中國(guó));丙烯酰胺快速電泳預(yù)混液(1610183,Bio-Rad,美國(guó));0.2 μm PVDF膜(162-0177,Bio-Rad,美國(guó));PSEN1(GTX101028,GeneTex,美國(guó));β-actin(8H10D10,Abgent,美國(guó));TBST(T1081-500,索萊寶,美國(guó)); Goat Anti-Rabbit IgG(S0001,Affinity,美國(guó));Goat Anti-Mouse IgG(S0001,Affinity,美國(guó));Immopbilon Western Chemilum HRP Substrate(WBKLS0100,Merck,美國(guó));超速離心機(jī)(L8-80 M,Hermle,德國(guó));梯度PCR儀(TP600,TaKaRa,日本);實(shí)時(shí)熒光定量RCR(CFX-96,Bio-Rad,美國(guó));凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc 2000,Bio-Rad,美國(guó))
1.2.1 樹鼩PSEN1 cDNA的分子克隆
(1)PSEN1引物設(shè)計(jì)
根據(jù)Genbank已經(jīng)注冊(cè)登記的人PSEN1(NM 000021.3)、小鼠PSEN1(NM 001362271.1)和黑猩猩PSEN1(NM 001132655.1)的保守序列,設(shè)計(jì)表1中的4組引物,該4組引物分別覆蓋了樹鼩PSEN1 mRNA的整個(gè)編碼區(qū)(表1)。
表1 樹鼩PSEN1和內(nèi)參GAPDH的引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design of the tree shrew PSEN1 and GAPDH
(2)RNA與cDNA制備
取腦組織放入1.5 mL離心管,采用柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取組織總RNA,并采用3’adaptor 引物和M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit M-MuLV試劑盒一步法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并去除基因組DNA污染。
(3)普通PCR
以3’adaptor為反轉(zhuǎn)錄引物的cDNA為模版,采用表1中PSEN1-F和PSEN1-R中間序列擴(kuò)增引物和TaKaRa Ex Taq? Hot Start Version試劑盒進(jìn)行普通PCR,進(jìn)行基因調(diào)取。循環(huán)參數(shù):95℃ 3min;94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min、33個(gè)循環(huán);72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收測(cè)序。
(4)3’RACE巢式PCR
以3’adaptor為反轉(zhuǎn)錄引物的cDNA為模版,采用3’RACE 特異性引物和接頭引物進(jìn)行巢氏PCR。
采用PSEN1-F1和5.3’outer引物進(jìn)行第一輪PCR,循環(huán)參數(shù):95℃ 3 min;94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min、33個(gè)循環(huán);72℃ 7 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模版,采用PSEN1-F2和5.3’inner引物進(jìn)行第二輪PCR,循環(huán)參數(shù):95℃ 3 min;94℃ 30 s、 58℃ 58 s、72℃ 1 min、33個(gè)循環(huán);72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物電泳后回收測(cè)序。
(5)5’RACE巢式PCR
以特異性引物PSEN1-RT1、PSEN1-RT2進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA,經(jīng)RNase H 和TdT處理后,采用5’RACE 特異性引物和接頭引物進(jìn)行巢氏PCR。以5’adaptor和PSEN1-R1為引物進(jìn)行第一輪PCR,循環(huán)參數(shù):95℃ 3 min;94℃ 30 s、68℃ 30 s、72℃ 1 min、33個(gè)循環(huán);72℃ 7 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模版,采用5.3’outer和PSEN1-R2引物進(jìn)行第二輪PCR,循環(huán)參數(shù): 95℃ 3 min;94℃ 30 s、68℃ 68 s、72℃ 1 min、33個(gè)循環(huán);72℃ 7 min,PCR產(chǎn)物電泳后回收測(cè)序。
(6)測(cè)序
PCR產(chǎn)物交由公司(生工生物工程股份有限公司)(上海)測(cè)序。將PCR純化產(chǎn)物插入pMD-18T載體后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,最終進(jìn)行雙向測(cè)序。進(jìn)行序列拼接得到全長(zhǎng)編碼序列,拼接時(shí)要求序列間堿基重合大于40 bp,一致性大于90%。
1.2.2 分子特征分析
本文用于參考的核酸及氨基酸序列均來(lái)源于GenBank,以NCBI、DNAMAN 5.0和MEGA 6.0分別進(jìn)行核酸序列、氨基酸序列、物種間親緣關(guān)系分析。
1.2.3PSEN1的表達(dá)模式分析
(1)RNA相對(duì)表達(dá)定量
從樹鼩的13個(gè)組織(其中腦組織分別取材頂葉、額葉、顳葉、枕葉、海馬體和小腦)中提取總RNA。在MyIQ2雙色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上,使用One Step TB GreenTMPrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit(Perfect Real Time)和表1中的PSEN1特異性引物(PSEN1-F3和PSEN1-R3)與內(nèi)參GAPDH特異性引物(GAPDH-F和GAPDH-R)進(jìn)行qRT-PCR。
(2)Western Blot
對(duì)收集的13個(gè)組織提取蛋白,超聲波破碎儀破碎組織,并用含PMSF的裂解液裂解細(xì)胞。蛋白濃度測(cè)定按照碧云天(增強(qiáng)型)BCA試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行。采用Western Blot標(biāo)準(zhǔn)方法,25 mg總蛋白的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。采用0.2 μm的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,分別用抗PSEN1和β-actin抗體(稀釋濃度1∶1000)4℃過(guò)夜孵育,TBST清洗3次,每次10 min。搖床常溫孵育goat anti-rabbit IgG與goat anti-mouse IgG二抗(HRP標(biāo)記,稀釋濃度1∶5000)60 min,TBST清洗3次,每次10 min。最后采用ECL底物化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色, Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。使用Image J軟件對(duì)PSEN1蛋白條帶測(cè)定灰度值。
以樹鼩腦組織總RNA為材料,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序。將中間序列及5’和3’RACE實(shí)驗(yàn)得到的序列進(jìn)行拼接,得到1680 bp的核酸片段。將樹鼩PSEN1 PCR 產(chǎn)物經(jīng)T/A 克隆并雙向測(cè)序,得到樹鼩PSEN1基因全長(zhǎng)編碼序列(GenBank登錄號(hào):MK135065),開放閱讀框長(zhǎng)度為1128 bp,編碼375個(gè)氨基酸(圖1)。
利用MEGA 6.0 軟件對(duì)樹鼩與人(NM 000021.4、NM 007318.2)、黑猩猩(NM 001132655.1)、獼猴(NM 001266480.1)、小鼠(NM 001362271.1)、大鼠(NM 019163.3)等13個(gè)物種的PSEN1基因進(jìn)行親緣關(guān)系分析并構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn),如圖2所示,可觀察到樹鼩與人、黑猩猩及恒河猴的遺傳距離較近,而與大鼠、小鼠距離較遠(yuǎn),說(shuō)明樹鼩PSEN1基因在進(jìn)化關(guān)系上更接近于人、黑猩猩和獼猴。
利用Protein BLAST及Clustal W 2.0對(duì)樹鼩與人(NM 000021.4、NM 007318.2)、黑猩猩(NM 001132655.1)、獼猴(NM 001266480.1)、小鼠(NM 001362271.1) 及大鼠(NM 019163.3)等哺乳動(dòng)物的PSEN1氨基酸序列進(jìn)行比較分析,同樣發(fā)現(xiàn)樹鼩PSEN1氨基酸序列與人、黑猩猩及獼猴同源性較高(分別為97.6%、97.07%及96.58%),而與小鼠、大鼠的同源性較低 (分別為95.47%及94.95%),比對(duì)結(jié)果如圖3所示。
為進(jìn)一步研究樹鼩PSEN1的表達(dá)模式,我們采用相對(duì)qRT-PCR法測(cè)定PSEN1在樹鼩不同組織中mRNA表達(dá)水平。如圖4A所示,PSEN1在腦組織表達(dá)較高,尤其在頂葉和額葉中,在其他臟器組織中的表達(dá)水平較低,脾臟和肌肉組織PSEN1表達(dá)水平中等,而胰腺組織PSEN1表達(dá)水平最低。我們進(jìn)一步檢索了人、小鼠和大鼠PSEN1表達(dá)信息(www.biogps.org),并與樹鼩PSEN1在各個(gè)組織中的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比,繪制了聚類熱圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSEN1在樹鼩額葉表達(dá)最高,在大鼠、小鼠的海馬表達(dá)最高,在人的枕葉表達(dá)最高,PSEN1在外周組織的表達(dá)量均較低(圖4B)。
為了評(píng)估PSEN1蛋白的表達(dá),我們使用人類的抗PSEN1抗體對(duì)樹鼩的13個(gè)組織進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)PSEN1的表達(dá)水平。在所有檢測(cè)組織中除了心臟和肌肉,其他均表達(dá)了PSEN1蛋白(圖5 A)。為了進(jìn)一步確認(rèn)樹鼩13個(gè)組織PSEN1蛋白的表達(dá)量,使用Image J軟件對(duì)PSEN1蛋白條帶測(cè)定灰度值。通過(guò)計(jì)算PSEN1蛋白灰度值和β-Actin蛋白灰度值的比值(圖5B),結(jié)果表明PSEN1在腦組織高表達(dá),其中表達(dá)最高的部位為小腦。外周組織表達(dá)較低,其中在肝表達(dá)量最低。
圖1 樹鼩PSEN1核苷酸序列及對(duì)應(yīng)氨基酸Figure 1 Nucleotide sequences and corresponding amino acids of the tree shrew PSEN1
注:自展值:1000次。方法:鄰接法。圖2 樹鼩PSEN1系統(tǒng)發(fā)育樹分析Note. Bootstrap: 1000 replicates. Method: Neighbor-joining method.Figure 2 Phylogenetic tree of the tree shrew PSEN1
注:相同的氨基酸用·表示,缺失的氨基酸用-表示。圖3 PSEN1氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Note. Identical amino acids are shown by a dot, gaps are represented by a dash.Figure 3 Comparison of the PSEN1 amino-acid sequences
注:A:樹鼩13種組織中PSEN1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分析。 B:樹鼩與人類、小鼠和大鼠13個(gè)組織中PSEN1的表達(dá)量聚類熱圖。黑框表示缺失該信息。圖4 樹鼩PSEN1 mRNA表達(dá)譜Note. A, Quantitative real-time PCR analysis of PSEN1 mRNA expression in 13 organ tissues of tree shrew. B, Heat map of PSEN1 gene expression in 13 organ tissues of tree shrew, human, mouse and rat. Black boxes indicated missing information.Figure 4 Expression profile of PSEN1 mRNA in the tree shrew
注:A:樹鼩13種組織中PSEN1蛋白的表達(dá)分析;B:樹鼩13種組織的PSEN1蛋白定量分析。圖5 樹鼩PSEN1蛋白表達(dá)Note. A. Expression of PSEN1 protein in 13 organ tissues of tree shrew. B, Quantitative analysis of PSEN1 protein in 13 organ tissues of tree shrew.Figure 5 Expressions of PSEN1 protein in the tree shrew
在本研究中,我們對(duì)樹鼩PSEN1基因克隆并測(cè)序,得到了全長(zhǎng)序列。以樹鼩和其他13類物種的PSEN1序列,采用鄰接法、最大似然法和最小簡(jiǎn)約法三種構(gòu)建法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)三種系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)點(diǎn)、進(jìn)化分支和分支長(zhǎng)度都極為相似,說(shuō)明構(gòu)建PSEN1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹是準(zhǔn)確的。以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明,樹鼩PSEN1比小鼠、大鼠更接近人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(圖2)。將樹鼩PSEN1與人類、非人靈長(zhǎng)類及大小鼠等5類物種進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)樹鼩PSEN1氨基酸序列與人類的同源性接近97.6%(圖3)。
我們采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)樹鼩13個(gè)組織中PSEN1基因進(jìn)行相對(duì)定量分析,發(fā)現(xiàn)樹鼩PSEN1在腦組織的表達(dá)量明顯高于外周組織。將樹鼩PSEN1表達(dá)量與在BioGPS上獲得的PSEN1在人類、小鼠和大鼠部分組織表達(dá)量繪制聚類熱圖進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PSEN1在樹鼩額葉表達(dá)最高,在大小鼠的海馬表達(dá)最高,在人的枕葉表達(dá)最高,而在外周組織的表達(dá)量均較低。同時(shí)從圖4B中也反映出,樹鼩PSEN1的表達(dá)水平比小鼠、大鼠的表達(dá)較高,這更有利于對(duì)PSEN1的功能研究。樹鼩PSEN1的氨基酸序列與人類的同源性高達(dá)97.6%,因此利用人PSEN1抗體來(lái)鑒定樹鼩PSEN1蛋白是可行的。在對(duì)樹鼩13個(gè)組織的PSEN1蛋白的表達(dá)進(jìn)行Western Blot分析時(shí)發(fā)現(xiàn)樹鼩小腦組織的PSEN1表達(dá)要遠(yuǎn)高于其他組織(圖5B)。通過(guò)上述對(duì)PSEN1基因和蛋白的表達(dá)分析,兩者之間的表達(dá)結(jié)果存在一定的差距,推測(cè)PSEN1在大腦的表達(dá)有自分泌和旁分泌模式[11],也說(shuō)明樹鼩PSEN1具有較為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控模式,因此樹鼩可能是開展PSEN1基因表達(dá)機(jī)制研究的良好動(dòng)物模型。
Western Blot分析結(jié)果顯示,PSEN1在樹鼩大腦中的顳葉、海馬體與小腦中表達(dá)水平較高。研究顯示:顳葉負(fù)責(zé)處理聽覺(jué)信息,并與記憶和情感有關(guān)[12];海馬體主要負(fù)責(zé)記憶存儲(chǔ)、信息處理和定向等功能[13];小腦不僅負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)功能還負(fù)責(zé)處理與知覺(jué)、語(yǔ)言及認(rèn)知等功能外的非運(yùn)動(dòng)功能[14]。此前,大量早期研究表明,阿爾茨海默病(AD)患者或AD 模型鼠的大腦皮層顳葉和海馬體內(nèi)有大量Aβ沉積[15]。但后續(xù)隨著臨床研究的不斷發(fā)現(xiàn),AD 病人小腦內(nèi)會(huì)出現(xiàn)與大腦皮層和海馬體相似的形態(tài)變化,并且小腦后葉的萎縮伴隨著的是更加嚴(yán)重的認(rèn)知行為的損害[14]。PSEN1作為γ-分泌酶的核心部分,與β-分泌酶共同作用,將淀粉樣前體蛋白(APP)水解產(chǎn)生與AD直接相關(guān)的Aβ40和Aβ42[3-4,16]。PSEN1基因突變后并不損害γ-分泌酶的酶切功能,僅PSEN1構(gòu)像發(fā)生異構(gòu)變化[17-18],使γ-分泌酶改變酶切位點(diǎn),導(dǎo)致 Aβ42/Aβ40比值增大。據(jù)此我們推測(cè),腦組織中PSEN1高表達(dá)的三個(gè)區(qū)域(顳葉、海馬體和小腦)可能會(huì)出現(xiàn)大量淀粉樣斑塊累積,進(jìn)而影響其功能,從而能引起個(gè)體產(chǎn)生符合AD部分臨床表現(xiàn)(如記憶障礙、失語(yǔ)、認(rèn)知功能減退、視空間定向和執(zhí)行功能障礙等)[12,19]。Fan等[6]也證實(shí),老年樹鼩與人類因Aβ累積而受累部位是一致的,主要是海馬體與大腦皮質(zhì)組織。這些證據(jù)都有力的表明樹鼩可以作為一個(gè)潛在的AD研究模型。
近年來(lái)的研究表明,PSEN1除了在AD中的作用,還發(fā)現(xiàn)在癌癥中也扮演重要角色。PSEN1參與Wnt[7]、Notch[8,20]信號(hào)通路的調(diào)控,并與PI3K-AKT-mTOR通路、Ras-Raf-MEK通路相互影響,影響結(jié)黑色素瘤[21]、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管生成等進(jìn)程[22-23]。但由于所影響的信號(hào)通路較多,導(dǎo)致PSEN1在不同細(xì)胞環(huán)境和組織中扮演著不同的角色,即可以表達(dá)出促癌的功能,也能表達(dá)可以抑癌的功能。
PSEN1基因是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一,該基因與AD、腫瘤等多種疾病相關(guān)。對(duì)于AD的藥物治療,現(xiàn)階段效果最卓越的藥物靶點(diǎn)就是γ-分泌酶,因此針對(duì)PSEN1深入研究將有助于研制有效的抗AD藥物。另外,目前以AD所建立的成熟動(dòng)物模型只有轉(zhuǎn)基因小鼠[24],但由于物種差異,治療策略和藥物并不能成功地轉(zhuǎn)化到人類身上。現(xiàn)階段已有研究者證明,樹鼩可以作為一個(gè)可行的、理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于AD研究[6,25]。隨著PSEN1基因和樹鼩動(dòng)物模型研究的不斷深入,相信它會(huì)在AD的治療和藥物研究等方面起到愈來(lái)愈大的作用。
綜上,本研究通過(guò)調(diào)取樹鼩PSEN1基因,獲得其全長(zhǎng)編碼序列,通過(guò)系列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化等分析發(fā)現(xiàn)樹鼩PSEN1基因比小鼠、大鼠更接近人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物,有助于了解 PSEN1在Aβ發(fā)生、AD發(fā)展中的作用,有利于樹鼩PSEN1單克隆抗體的合成與制備,并為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)2019年4期