張 偉 王政潔 閆越穎 張杰娜 趙培慶

(菏澤市立醫(yī)院皮膚性病科，菏澤274000)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)引起的性傳播疾病。最新數(shù)據(jù)表明，我國梅毒發(fā)病率已達32.86/10萬，居全國甲乙類法定傳染病發(fā)病第3位，已成為嚴重影響我國公共衛(wèi)生與人民健康的社會問題[1]。梅毒螺旋體含有豐富的脂蛋白，可作為病原相關(guān)分子模式(PAMPs)通過CD14和Toll樣受體1(TLR1)以及TLR2依賴性信號通路激活巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)[2,3]。然而梅毒螺旋體表面由于獨特的外膜結(jié)構(gòu)存在，導(dǎo)致缺乏暴露的脂蛋白成分，因此這些PAMPs不容易被TLRs或其他模式識別受體(PRRs)識別，從而造成梅毒螺旋體在組織中可長期復(fù)制并傳播[4]。研究發(fā)現(xiàn)，患者感染的皮膚局部除了CD4+和CD8+T細胞外，還有大量CD56+NK細胞浸潤，其可能的機制是通過分泌IFN-γ參與皮膚巨噬細胞的激活[5]，提示NK細胞在梅毒患者的疾病進程中發(fā)揮重要作用。

T細胞免疫球蛋白與黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3(T cell immunoglobulin and mucin domain containing 3,Tim-3)是重要的免疫調(diào)節(jié)分子。在人類活化的CD4+(Th1)和CD8+細胞毒性T細胞(TC)上首次發(fā)現(xiàn)；其表達范圍較廣，包括NK細胞在內(nèi)幾乎所有免疫細胞上都有Tim-3的表達[6]。Tim-3的功能也異常復(fù)雜，與免疫系統(tǒng)的激活和抑制都密切相關(guān)[7]。但到目前為止，Tim-3在梅毒患者NK細胞上的表達與功能皆未知。本研究中，我們采用流式細胞術(shù)等實驗方法檢測梅毒患者外周血中Tim-3的表達情況并探討其初步功能，以期明確Tim-3在梅毒等性傳播疾病發(fā)生發(fā)展中的確切生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 病例獲取、試劑及儀器 早期梅毒患者外周血標(biāo)本由菏澤市立醫(yī)院皮膚性病科門診收集，并與患者簽署研究知情同意書?；颊呓?jīng)梅毒螺旋體明膠凝集試驗 (TPPA)及快速血漿反應(yīng)素試驗 (RPR)確診，且未經(jīng)治療的早期梅毒患者78例[其中一期患者34例，二期患者40例，隱性梅毒患者4例；其中男62例，年齡(31.0±16.9)歲，女16例，年齡27.0±22.4)歲]。正常對照外周血標(biāo)本80例取自菏澤市立醫(yī)院健康體檢中心，排除任何感染性疾病、自身免疫性疾病等可能影響Tim-3及NK細胞表達情況的疾病。流式抗體CD3、CD16、CD56為Biolegend公司產(chǎn)品(Cat# 300327,Cat#302011,Cat#304605,Biolegend,USA)，Human Tim-3為R&D公司產(chǎn)品(#344823,R&D,USA)，Lysing Buffer 為BD公司產(chǎn)品(#555899,BD,USA)，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，PBS溶液購自Hyclone公司，人IL-2重組蛋白購自CST公司(#8907,CST,USA)，人IL-12及IL-18重組蛋白購自R&D公司(Catalog #219 IL,Catalog #119 BP,R&D,USA)，多功能酶標(biāo)儀產(chǎn)自賽默飛世爾公司(VarioskanFlash)，流式細胞儀產(chǎn)自美國BD公司(Aria2),Tim-3及STAT1干擾慢病毒載體由上海吉凱基因有限公司構(gòu)建(GeneChem,Shanghai)。

1.2 方法

1.2.1 外周血NK細胞的檢測 取患者及正常對照EDTA-K2抗凝外周血100 μl置于流式管底部，依次加入3 μl CD3、CD16、CD56、Tim-3流式抗體，室溫避光30 min；加入1×Lysing Buffer 2 ml，渦旋混勻，置于室溫避光15 min；1 000 r/min離心5 min后棄上清，然后用含0.5%小牛血清的PBS洗滌一次；棄上清，加入約1 ml PBS，充分混勻，上機檢測。

1.2.2 外周血NK細胞分離與培養(yǎng) 按儀器要求調(diào)整液流，使液流穩(wěn)定；然后用微球調(diào)節(jié)斷點，先調(diào)節(jié)Ampl，使Gap線位于中上且下面兩個數(shù)值保持穩(wěn)定；分選時，把實際Drop1和Gap值輸入設(shè)定窗口，并點擊Sweet Spot鎖定。常規(guī)制備無菌管路，以CD3-、CD16+、CD56bright或CD56dim設(shè)門分別分選CD56bright及CD56dim兩群NK細胞，細胞分選成功后，加入IL-2(1 000 U/ml)刺激NK細胞增殖，并在含有雙抗的細胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 ELISA檢測血清及培養(yǎng)上清中細胞因子的分泌 采集患者及正常對照5 ml無抗凝劑外周血標(biāo)本，待標(biāo)本完全凝集后充分離心(1 500 r/min離心20 min)，以徹底去除可能影響檢測的雜質(zhì)。然后取上清50 μl進行細胞因子檢測，并設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照孔。具體實驗步驟參照試劑說明書，最后用多功能酶標(biāo)儀在吸光度450 nm處進行讀數(shù)，讀取各孔OD值；繪制標(biāo)準曲線，計算患者及正常對照血清中細胞因子的濃度。

1.2.4 流式細胞儀檢測胞內(nèi)蛋白IFN-γ水平 收獲培養(yǎng)的細胞1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入500 μl 固定液對細胞進行固定，置室溫10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入1.5 ml破膜劑置室溫10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入含0.5%小牛血清的PBS重懸細胞，加入適量抗IFN-γ流式抗體室溫孵育30 min；過400目細胞篩，上機檢測。

1.2.5 Western blot檢測培養(yǎng)細胞中信號通路蛋白的變化 利用蛋白裂解液(含RIPA)抽提細胞總蛋白質(zhì)，裂解完成后酶標(biāo)儀BCA法測蛋白濃度，進行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，最后將膜與磷酸化STAT1 抗體(#9167,CST,USA)，STAT1抗體(#14994,CST,USA)及GAPDH抗體進行孵育，膠片曝光檢測蛋白表達量， GAPDH為內(nèi)參對照，與目的蛋白比對后得到相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究統(tǒng)計學(xué)方法利用GraphpadPrism7.0.統(tǒng)計作圖軟件(GraphPad Software Inc.)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman′s rank方法進行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期梅毒患者NK細胞數(shù)量變化 早期梅毒患者與正常人外周血經(jīng)NK細胞標(biāo)記抗體標(biāo)記后(CD3-CD56+)進行流式分析，結(jié)果如圖1所示，患者NK細胞比值(10.8±4.6)與正常對照(9.97±5.02)之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 早期梅毒患者NK細胞上Tim-3表達水平變化 流式結(jié)果顯示梅毒患者NK細胞上Tim-3的表達水平較正常對照明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，P<0.05)；進一步分析發(fā)現(xiàn)，梅毒患者CD56dimNK上Tim-3表達差異更顯著(P<0.01)在CD56brightNK上Tim-3表達則差異較小(P=0.058)。一般情況下，CD56dim約占NK細胞總數(shù)的90%，表達中度親和力的IL-2受體(IL-2R)，其主要功能為細胞毒性作用，具有較強的殺傷活性；CD56bright則主要起免疫調(diào)節(jié)作用。本實驗結(jié)果初步提示Tim-3可能通過抑制CD56dim生物學(xué)功能，從而導(dǎo)致梅毒患者疾病的發(fā)展進程。

2.3 早期梅毒患者CD56dimNK細胞上Tim-3表達水平與血清中IFN-γ相關(guān)性分析 為進一步明確CD56dimNK細胞上Tim-3的生物學(xué)功能，我們分析了患者Tim-3表達與其血清中IFN-γ分泌水平的相關(guān)性，結(jié)果如圖3所示，Tim-3表達與其血清中IFN-γ 分泌水平呈明顯負相關(guān)性(P<0.01,r=-0.450 6)。

2.4 Tim-3影響CD56dimNK細胞中INF-γ的分泌水平 分選式流式細胞儀以CD56dim設(shè)門后對該群細胞進行分選，分選出的細胞置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并以IL-2(1 000 U/ml)刺激該群細胞增殖。待細胞擴增后以1×104密度接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染Tim-3干擾慢病毒載體及對照載體，流式細胞儀及ELISA檢測IFN-γ水平，結(jié)果如圖4所示，干擾Tim-3表達后，不管是CD56dimNK細胞中的IFN-γ表達水平，還是培養(yǎng)上清中的IFN-γ水平皆明顯上調(diào)。

圖1 早期梅毒患者NK細胞數(shù)量與正常人的比較Fig.1 Comparison of number of NK cells between patie-nts with early stage syphilis and control groupNote: A.Analysis of the ratio of NK cells by flow cytometry；B.There was no significant difference for the ratio of circulating NK cells between patients with early syphilis and controls(P>0.05).

圖2 早期梅毒患者NK細胞上Tim-3表達水平明顯上調(diào)Fig.2 Up-regulation of Tim-3 on NK cells in patients with early stage syphilisNote: A.The expression level of Tim-3 on peripheral NK cells was significantly different from controls in patients with early stage syphilis (P<0.05);B.The expression level of Tim-3 was up-regulated on CD56dimNK cells in patients with early stage syphilis (P<0.01);C.There was no significant difference for Tim-3 on CD56brightNK cells between patients with early stage syphilis and controls (P=0.058).

圖3 早期梅毒患者CD56dimNK細胞中Tim-3表達水平與血清中IFN-γ水平負相關(guān)Fig.3 Tim-3 expression level on CD56dimNK cells from patients with early syphilis was negatively correlated with the serum IFN-γ level

圖4 干擾CD56dimNK細胞中Tim-3的表達后，IFN-γ分泌水平上調(diào)Fig.4 Up-regulation of IFN-γ after interference with Tim-3 on CD56dimNK cellsNote: A.Detection of Tim-3 interference determined by Western blot;B.After interfering with Tim-3 on CD56dimNK cells,the level of IFN-γ secretion was up-regulated (P<0.01);C.The supernatant IFN-γ level was up-regulated after interfering with Tim-3 on CD56dimNK cells (P<0.01).

2.5 Tim-3通過JAK-STAT1通路調(diào)控IFN-γ分泌Western blot檢測梅毒患者CD56dimNK細胞JAK-STAT1通路蛋白變化，結(jié)果如圖5所示，p-STAT1蛋白在IL-12和IL-18的刺激下較正常對照明顯下調(diào)，干擾CD56dimNK細胞中Tim-3的表達后則JAK-STAT1通路蛋白表達上調(diào)，同時上清中IFN-γ分泌水平增高(P<0.01)。為進一步明確該通路在Tim-3介導(dǎo)IFN-γ分泌中的作用，我們干擾CD56dimNK細胞中Tim-3表達的同時，也對STAT1蛋白進行干擾，結(jié)果顯示IFN-γ升高現(xiàn)象消失(P>0.05)，提示Tim-3主要是通過JAK-STAT1通路調(diào)控IFN-γ分泌。

圖5 Tim-3通過JAK-STAT1通路調(diào)控IFN-γ分泌Fig.5 Tim-3 regulates IFN-γ secretion via JAK-STAT1pathwayNote: A.p-STAT1 protein in CD56dimNK cells is significantly down-regulated in patients with syphilis;B.Up-regulation of p-STAT1 protein in CD56dimNK cells after Tim-3-sh transfected;C.Detection of STAT1 interference using Western blot method.Tim-3 regulates IFN-γ secretion via the JAK-STAT1 pathway;D.IFN-γ was up-regulated in the culture supernatant in CD56dimNK cells after interference with Tim-3 (P<0.01).Tim-3 regulates IFN-γ secretion via the JAK-STAT1 pathway;E.There was no significant difference for IFN-γ in CD56dimNK cells when both interference with STAT1 and Tim-3 (P>0.05).

3 討論

人類NK細胞是一群異質(zhì)性細胞群體，一般分為CD56dim和CD56bright兩個亞群。 外周血中CD56dim約占NK細胞總數(shù)的90%，其功能主要為細胞毒性反應(yīng)，在各類感染性疾病中發(fā)揮重要作用。相反，CD56bright只占外周血中NK細胞總數(shù)的10%，該類細胞主要生物學(xué)功能是免疫調(diào)節(jié)作用，可能在自身免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8,9]。與 CD56brightNK細胞不同，CD56dimNK細胞表達CD16 (Fcγ受體) 和KIR 受體[10]。在抗病原體感染方面，NK細胞一方面通過細胞與細胞直接接觸來殺傷受病原體感染的細胞，另一方面通過分泌細胞因子(如IFN-γ)來控制病原體在細胞中的增殖[11]，因此NK細胞在抗擊病原體感染的第一線發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。但相關(guān)研究表明早期梅毒患者IFN-γ分泌水平往往低于正常人，從而導(dǎo)致病原體清除障礙。

人Tim基因家族主要包括Tim-1、 Tim-3和 Tim-4，該家族成員與免疫調(diào)節(jié)、感染等密切相關(guān)。課題組前期研究表明Tim-4可以調(diào)控巨噬細胞免疫學(xué)功能，在SLE、糖尿病、膿毒血癥等炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵生物學(xué)作用[12-15]。但Tim-3與其他兩個成員不同，它幾乎在所有免疫細胞中皆有表達，可以調(diào)控幾乎所有細胞的功能。但到目前為止它通過調(diào)控NK細胞參與梅毒等性傳播疾病的機制還不清楚。有研究報道梅毒患者外周血NK細胞數(shù)量較正常對照低[16]，但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NK細胞總數(shù)在梅毒患者與正常對照之間無統(tǒng)計學(xué)差異，可能的原因是檢測群體差異導(dǎo)致。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)CD56dimNK細胞上Tim-3的表達水平差異非常顯著，由于Tim-3是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，因此我們認為Tim-3可能通過調(diào)控CD56dimNK細胞在梅毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵生物學(xué)功能。

CD56dim主要表達中度親和力的IL-2受體(IL-2R)，主要功能是行使細胞毒性作用，具有較強的殺傷活性。有研究表明乙肝患者外周血中CD56dimNK細胞可分泌大量IFN-γ，進而導(dǎo)致乙肝病毒持續(xù)感染[17]，表明CD56dimNK細胞可能通過調(diào)控IFN-γ的分泌水平參與感染性疾病的病理進程。由于我們發(fā)現(xiàn)早期梅毒患者CD56dimNK細胞中Tim-3表達水平與血清中IFN-γ水平明顯負相關(guān)，提示Tim-3可能是該進程中的關(guān)鍵調(diào)控分子。已有研究表明Tim-3在成熟NK細胞上高表達，體外實驗發(fā)現(xiàn)NK細胞上的Tim-3具有共刺激功能。在腫瘤模型中，Tim-3的表達與預(yù)后負相關(guān)，主要功能是抑制抗腫瘤作用，阻斷Tim-3可逆轉(zhuǎn)某些腫瘤中NK細胞的衰竭狀態(tài)，表明Tim-3通過調(diào)控NK細胞促進了腫瘤的進展過程[18]。在感染性疾病如HIV患者中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)表達Tim-3的CD8+T細胞在功能上呈現(xiàn)耗竭狀態(tài)，Tim-3表達水平也與病毒載量正相關(guān)[19]。在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染者中，高表達的Tim-3也與T細胞功能耗竭相關(guān)，抗Tim-3治療后可以使T細胞毒性功能部分恢復(fù)，并能顯著降低病毒滴度[20]。Tim-3在某些胞內(nèi)細菌如結(jié)核分枝桿菌感染中，Tim-3的表達可促進人類T細胞功能增強，利用小鼠模型發(fā)現(xiàn)Tim-3有助于在結(jié)核分枝桿菌感染過程中維持T細胞的耗竭狀態(tài)。機制上，T細胞上的Tim-3與其配體Gal-9相互作用，后者又可刺激巨噬細胞，從而增強抗菌功效。因此Tim-3對免疫功能的調(diào)控具有雙向性[21]。本研究中，CD56dimNK細胞上高表達的Tim-3生物學(xué)功能到底如何？我們首先分析了梅毒患者Tim-3表達水平與血清中IFN-γ分泌水平的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-3的表達與血清中IFN-γ分泌水平呈明顯負相關(guān)性。IFN-γ等Th1型細胞因子可增強T細胞免疫功能，在促進梅毒螺旋體清除以及皮損愈合方面起重要作用。因此，我們初步認為CD56dimNK細胞上高表達的Tim-3可能抑制了IFN-γ的分泌，從而導(dǎo)致梅毒螺旋體的清除障礙。為進一步深入探討Tim-3通過調(diào)控CD56dimNK細胞對IFN-γ分泌水平的影響，我們分選出CD56dimNK細胞，同時轉(zhuǎn)染Tim-3干擾慢病毒載體及對照載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Tim-3表達后，不管是CD56dim中的IFN-γ表達，還是培養(yǎng)上清中的IFN-γ水平皆明顯上調(diào)。該結(jié)果更進一步明確了我們的理論推測。文獻結(jié)果表明IFN-γ的分泌主要受JAK-STAT1通路的正向調(diào)控[22]?；谝陨侠碚摶A(chǔ)，我們檢測了梅毒患者CD56dimNK細胞中JAK-STAT1通路蛋白表達變化，結(jié)果顯示梅毒患者CD56dimNK細胞中JAK-STAT1通路蛋白在IL-12和IL-18的刺激下較正常對照明顯下調(diào)，干擾CD56dimNK細胞中Tim-3的表達后則JAK-STAT1通路蛋白表達上調(diào)，同時上清中IFN-γ分泌水平增高，該結(jié)果進一步明確Tim-3主要通過調(diào)控JAK-STAT1通路進而影響CD56dimNK細胞中IFN-γ的分泌水平。為進一步明確該通路在Tim-3介導(dǎo)IFN-γ分泌中的作用，我們干擾CD56dimNK細胞中Tim-3表達的同時，也對STAT1蛋白進行干擾，結(jié)果顯示IFN-γ升高現(xiàn)象消失。以上結(jié)果更進一步表明Tim-3通過JAK-STAT1通路調(diào)控IFN-γ分泌，進而影響梅毒患者的疾病進程。

總之，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)Tim-3通過下調(diào)JAK-STAT1通路蛋白，進而導(dǎo)致IFN-γ分泌減少。由于IFN-γ是梅毒螺旋體清除過程中的重要細胞因子，因此高表達的Tim-3水平可能抑制了梅毒螺旋體的清除進程，最終影響了梅毒患者的疾病進程。

綜上所述，我們的結(jié)果初步闡釋了Tim-3可能參與梅毒疾病進程的分子機制，為闡明梅毒發(fā)生發(fā)展提供了新的理論基礎(chǔ)，可能在梅毒的預(yù)后判斷中發(fā)揮重要作用。