王樂 錢毅駿

在肝臟受到肝炎病毒感染或受損時(shí)，其中肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞可釋放大量促炎性介質(zhì)，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)等，使得肝星狀細(xì)胞激活，使之處于活化狀態(tài)，最終造成膠原的形成[1]。本研究通過構(gòu)建四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，探討活性維生素D3聯(lián)合α-干擾素(interferon-α，IFN-α)對(duì)小鼠肝纖維化程度及細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

資料與方法

一、一般材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量15～25 g。

主要試劑與儀器：z480型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀購(gòu)自羅氏診斷公司，四氯化碳購(gòu)自江蘇南大光電材料股份有限公司，TRIzol試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司，重組人IFN-α2b購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司，活性維生素D3江蘇佰耀生物科技有限公司。

二、方法

模型的構(gòu)建及分組：經(jīng)腹腔注射10%四氯化碳5 μL/g，每周3次，共注射2周，成功構(gòu)建肝纖維化小鼠模型后，將小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(皮下注射0.9%生理鹽水100 μL，隔日1次)、單藥1組(口服灌胃活性維生素D3 50 μg/kg，隔日1次)、單藥2組(皮下注射IFN-α 800 U，隔日1次)、聯(lián)合組(給予活性維生素D3+IFN-α，用法與用量與單藥組相同)，每組各5只，另選取5只小鼠為正常對(duì)照組(皮下注射0.9%生理鹽水100 μL，隔日1次)。

肝纖維化的檢查：采集各組小鼠肝臟組織，行組織病理學(xué)檢查，對(duì)組織進(jìn)行切片后行蘇木精-伊紅染色，并根據(jù)其嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)[5]，分為0級(jí)：無纖維化，肝臟組織正常；Ⅰ級(jí)：存在纖維化，竇周與小葉內(nèi)纖維化，匯管區(qū)纖維化增大；Ⅱ級(jí)：輕度纖維化，匯管區(qū)周圍纖維化，形成纖維間隔，小葉結(jié)構(gòu)無異常；Ⅲ級(jí)：中度纖維化，形成纖維間隔，且小葉結(jié)構(gòu)異常，但未出現(xiàn)肝硬化；Ⅳ級(jí)：重度纖維化，形成纖維間隔且增厚，并出現(xiàn)諸多假小葉。

細(xì)胞因子含量的檢測(cè)：通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)各組小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-β、TNF-α及IL-6的含量進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書指示完成檢測(cè)操作。

Smad3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)：對(duì)各組小鼠肝組織中的總RNA夾心提取，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后行RT-qPCR。反應(yīng)條件：95℃進(jìn)行預(yù)變性30 s，以相同溫度進(jìn)行變性10 s，之后以60℃退火30 s，以相同溫度進(jìn)行延伸60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，并以β-actin作為內(nèi)參。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、組織病理學(xué)檢查結(jié)果

陰性對(duì)照組肝索排列不齊，肝小葉結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞水腫，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)出現(xiàn)諸多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且伴有纖維組織增生，脂肪變性明顯，形成纖維間隔，伴有小葉結(jié)構(gòu)異常；單藥1、2組及聯(lián)合組小葉結(jié)構(gòu)未見破壞，但出現(xiàn)少量纖維間隔，匯管區(qū)纖維組織增生且出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；正常對(duì)照組無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索整齊排列，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝小葉間未出現(xiàn)纖維組織增生，匯管區(qū)未見纖維化。見圖1。

二、肝纖維化分級(jí)結(jié)果

單藥1、2組及聯(lián)合組肝纖維化程度接近，無顯著性差異；但陰性對(duì)照組肝纖維化程度較其它組明顯加重。見表1。

表1 各組小鼠肝纖維化分級(jí)結(jié)果(例)

三、細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，單藥1、2組及聯(lián)合組TGF-β和TNF-α含量較正常對(duì)照組明顯升高，但較陰性對(duì)照組明顯下降(P<0.05)；單藥1、2組IL-6含量較其它組明顯下降(P<0.05)，聯(lián)合組IL-6含量較陰性對(duì)照組明顯下降，但較單藥1、2組明顯升高(P<0.05)。見表2。

四、Smad3 mRNA的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、單藥1組、單藥2組、聯(lián)合組小鼠Smad3 mRNA表達(dá)水平分別為(1.02±0.03)、(3.08±0.82)、(0.67±0.22)、(0.66±0.24)、(0.70±0.25)。結(jié)果顯示，單藥1、2組及聯(lián)合組Smad3 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。

討 論

活性維生素D3即為維生素的的活性形式，其對(duì)骨鈣鹽沉積及鈣磷代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。既往研究報(bào)道[3-4]，活性維生素D3對(duì)適應(yīng)性及先天性免疫功能及其細(xì)胞的生成和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用，且可阻滯心肌、肺、肝臟及腎臟纖維化的進(jìn)展。已有研究表明[5-6]，IFN-α可通過調(diào)控肝臟細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞水平直接起到抗纖維化的作用。活性維生素D3與IFN-α均可起到良好的抗纖維化作用，二者的相關(guān)機(jī)制存在一定的交叉重疊。本研究發(fā)現(xiàn)，單藥1、2組及聯(lián)合組肝纖維化程度接近，無顯著性差異；但陰性對(duì)照組肝纖維化程度較其他組明顯加重。并且，單藥1、2組及聯(lián)合組小葉結(jié)構(gòu)未見破壞，但出現(xiàn)少量纖維間隔，匯管區(qū)纖維組織增生且出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而陰性對(duì)照組肝臟匯管區(qū)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果表明，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用活性維生素D3與IFN-α均具有抗纖維化作用但聯(lián)合應(yīng)用不存在疊加效應(yīng)。

注：A：正常對(duì)照組，B：陰性對(duì)照組，C：?jiǎn)嗡?組，D組：?jiǎn)嗡?組，E：聯(lián)合組

組別nTGF-βTNF-αIL-6正常對(duì)照組520.09±5.134.87±0.3537.07±4.12陰性對(duì)照組5454.95±144.0515.09±3.2244.98±5.12a單藥1組5378.97±86.23ab8.35±1.43ab18.97±3.22ab單藥2組5372.14±97.58ab8.29±1.57ab18.88±2.95ab聯(lián)合組5382.85±74.86ab8.14±1.63ab36.98±3.85bcdF96.4610.0316.97P<0.01<0.01<0.01

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP<0.05；與單藥1組，cP<0.05；與單藥2組比較，dP<0.05

TNF-α具有誘導(dǎo)肝內(nèi)纖維母細(xì)胞和Ito細(xì)胞增殖的作用，且可使之轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞。IL-6可通過刺激炎性反應(yīng)使得纖維化形成，同時(shí)可通過加強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的合成而對(duì)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起到促進(jìn)作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，單藥1、2組及聯(lián)合組TGF-β和TNF-α含量較正常對(duì)照組明顯升高，但較陰性對(duì)照組明顯下降；單藥1、2組IL-6含量較其它組明顯下降，聯(lián)合組IL-6含量較陰性對(duì)照組明顯下降，但較單藥1、2組明顯升高。結(jié)果表明，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用活性維生素D3、IFN-α均可時(shí)肝纖維化小鼠肝內(nèi)促炎性因子TNF-α與IL-6含量下降，但聯(lián)合應(yīng)用未能起到有效阻滯促炎性因子生成的作用，并且聯(lián)合治療后IL-6的療效差于單獨(dú)用藥組。究其原因，可能因活性維生素D3與IFN-α聯(lián)合治療可能存在拮抗效應(yīng)。

TGF-β、肝星狀細(xì)胞活化、基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子均在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且上述因素具有相互調(diào)節(jié)作用，可形成復(fù)雜的系統(tǒng)[8]。TGF-β是促進(jìn)組織纖維化形成的主要因子之一，其可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成，并且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解具有抑制作用[9]?；罨母涡菭罴?xì)胞具有表達(dá)促纖維化關(guān)鍵因子的受體的作用，如TGF-β1及血小板驅(qū)動(dòng)生長(zhǎng)因子等，可進(jìn)一步促進(jìn)相關(guān)信號(hào)通路的激活[10]。在發(fā)生肝纖維化時(shí)，Smad3可作為一種細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，作為調(diào)控肝纖維化進(jìn)展的主要因素，其可將信號(hào)由胞質(zhì)傳至細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)目的基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，并且可誘導(dǎo)膠原合成，活化肝星狀細(xì)胞[11]。據(jù)報(bào)道[12]，活性維生素D3與IFN-α可通過TGF-β/Smad3通路起到阻滯肝纖維化發(fā)生及發(fā)展的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，單藥1、2組及聯(lián)合組Smad3 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下降。結(jié)果表明，無論是單獨(dú)應(yīng)用活性維生素D3、IFN-α，亦或是聯(lián)合治療均可促使肝纖維化小鼠肝內(nèi)TGF-β含量及Smad mRNA表達(dá)水平降低。結(jié)果提示，活性維生素D3與IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合治療均具有良好的療效，但聯(lián)合治療并無疊加效應(yīng)。

綜上所述，活性維生素D3、IFN-α單獨(dú)或聯(lián)合治療肝纖維化小鼠具有相似的臨床療效，聯(lián)合治療并無疊加效應(yīng)。由于TGF-β/Smad3通路活化可有效促進(jìn)肝纖維化的形成，因此通過阻斷此通路可能是治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。