雷星，陳熹，趙琳，單濤

作者單位：1延安大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，陜西 延安 716000；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，陜西 西安 710004；3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心臟外科，陜西 西安 710032

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，它的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，重要特征是明顯的轉(zhuǎn)移傾向，轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究能夠?yàn)槠涮峁┲委熜滤悸罚?］。腫瘤的轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶遷移到遠(yuǎn)處并形成新病灶的過(guò)程。其主要步驟分為［2］：局部侵潤(rùn)、血管內(nèi)滲、循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)、血管外滲、定植灶形成。這其中可逆的轉(zhuǎn)變過(guò)程上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）扮演了重要角色［3］。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞在形成轉(zhuǎn)移灶后，又表現(xiàn)出與原來(lái)病灶腫瘤類(lèi)似的結(jié)構(gòu)［4］。據(jù)此Thiery［3］提出腫瘤轉(zhuǎn)移二階理論，該理論認(rèn)為腫瘤的侵潤(rùn)和循環(huán)播散需要EMT過(guò)程，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞要經(jīng)過(guò)其逆過(guò)程間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換（MET）來(lái)形成轉(zhuǎn)移灶?？上У哪壳癊MT-MET時(shí)空調(diào)控具體機(jī)制不明確，無(wú)法為腫瘤的治療提供新思路［5］。

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)細(xì)胞所用的氧分壓與空氣氧分壓相同，為160 mmHg，而生物體內(nèi)的氧分壓卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大氣中氧分壓，例如腦中為24 mmHg，肺中為110 mmHg，肝中為24 mmHg，心臟中為25 mmHg，脾中為66 mmHg，腎中為25 mmHg，微環(huán)境缺氧更是實(shí)體腫瘤顯著特征［6-7］。高氧或低氧是指細(xì)胞可利用氧的增多或減少，或環(huán)境氧分壓高于或低于臨界值的狀態(tài)?，F(xiàn)有的研究說(shuō)明缺氧通過(guò)HIF-1α信號(hào)通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)轉(zhuǎn)移；而高壓氧可直接抑制乳腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，這提示習(xí)慣于低氧環(huán)境的腫瘤細(xì)胞，腫瘤短時(shí)間內(nèi)無(wú)法適應(yīng)高氧環(huán)境，導(dǎo)致其生物學(xué)的變化［8］。Apostolou等［9］研究顯示，高壓氧可改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的可塑性，使其由EMT向MET轉(zhuǎn)變進(jìn)而降低腫瘤侵襲性。提示氧環(huán)境可賦予腫瘤細(xì)胞間質(zhì)上皮可塑性，而這一作用是否可用來(lái)解釋腫瘤二次轉(zhuǎn)移復(fù)原機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。為此本研究自2016年1月至2017年1月在體外模擬原發(fā)灶低氧環(huán)境，歸巢部位常氧或適度高氧環(huán)境，運(yùn)用激光共聚焦、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）等方法，觀察不同氧濃度下腫瘤細(xì)胞EMT、MET形態(tài)變化，探索結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移機(jī)制，為治療研究提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料RIPA裂解溶液盒購(gòu)于碧云天集團(tuán)。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)置于美國(guó)Sigma集團(tuán)。DMEM培養(yǎng)溶液和牛胎血清購(gòu)于美國(guó)HyClone集團(tuán)。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Millpore集團(tuán)。基質(zhì)凝膠和One-StepRT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD集團(tuán)。鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和肌動(dòng)蛋白（βactin）抗體購(gòu)于SantaCruz生物科技集團(tuán)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理人結(jié)腸癌細(xì)胞COLO205購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)于含100 ml/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100–g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)到80%融合時(shí)給予干預(yù)，分為低氧組（氧濃度5%）；常氧組（氧濃度21%）；輕度高氧組（氧濃度30%）。常氧組置于普通CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，低氧及高氧組則置于自制培養(yǎng)器皿中（10 cm×15 cm×25 cm），通入含有5%、30%O2或5%CO2的混合氣體。培養(yǎng)2 d后培養(yǎng)基更換為3 mL無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于普通CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3免疫熒光細(xì)胞培養(yǎng)后常規(guī)鋪片，滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS，浸潤(rùn)已知抗原標(biāo)本片10 min棄去。滴加適當(dāng)稀釋的抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本玻片，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30 min。玻片用0.01 mol/L，pH7.4的PBS沖洗1～2次，然后按順序過(guò)0.01 mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5 min，同時(shí)給予充分振蕩。用濾紙吸去水分，滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體，蓋搪瓷盒內(nèi)37℃保溫保持30 min。覆蓋蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中細(xì)胞的遷移能力。24孔板內(nèi)接種1×105細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，用無(wú)菌槍頭于單層細(xì)胞上劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3遍，培養(yǎng)24 h，ImageProPlus5.0觀察及照相。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)使用Transwell小室檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。小室聚碳酸酯膜上鋪100–L 1∶10稀釋并4℃預(yù)冷的基質(zhì)膠（用DMEM稀釋至5 mg/mL），把鋪好膠的小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h使基質(zhì)膠凝固并在聚碳酸酯膜上形成一層連續(xù)的薄膜。正常培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞并混勻于含0.1%胎牛血清白蛋白?；靹虻募?xì)胞均勻種于小室中的上室，500–L含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入小室中的下室做趨化因子。37℃下培養(yǎng)24 h，聚碳酸酯膜取出，用棉簽輕擦去基質(zhì)膠及上室的細(xì)胞，下室的細(xì)胞4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色。100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）用TRIzol試劑提取COLO205細(xì)胞總RNA。2 μg RNA用RevertAidkit合成第一條cDNA鏈。PCR引物設(shè)計(jì)：E-cadherin上游引物：5′-CAATGGTGTCCATGTGAACA-3′，下游引物：5′-CCTCCTACCCTCCTGTTCG-3′；vimentin上游引物：5′-CGCTTCGCCAACTACAT-3′，下游引物：5′-AGGGCATCCACTTCACAG-3′；βactin上游引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下 游 引 物 ：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。PCR反應(yīng)條件：首先94℃變性3min，再進(jìn)行 35個(gè)以下循環(huán)：94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃35 s。最終72℃5 min。管家基因β-actin用作內(nèi)參照。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外光下觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用one-wayANOVA方差分析法分析數(shù)據(jù)，首先利用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后進(jìn)一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同氧濃度下結(jié)腸癌EMT、MET變化為了檢測(cè)低氧是否對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT具有促進(jìn)作用，我們利用光鏡觀察癌細(xì)胞形態(tài)顯示：低氧干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)明顯由圓形變成紡錘形或長(zhǎng)梭形，排列方式較雜亂、無(wú)方向性，放射狀外觀（圖1）。激光共聚焦檢測(cè)實(shí)驗(yàn)評(píng)估COLO205細(xì)胞熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：低氧組結(jié)腸癌細(xì)胞Vimentin熒光強(qiáng)度高于常氧組和高氧組，而E-cadherin熒光強(qiáng)度低于常氧/高氧組（圖1）。提示低氧能夠增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT變化，而常氧/高氧可反轉(zhuǎn)EMT向MET轉(zhuǎn)化。

圖1 不同氧濃度下結(jié)腸癌EMT、MET變化（×400）

圖2 不同氧濃度下結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力變化（×200）：A為低氧組；B為常氧組；C為高氧組

2.2氧濃度對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力影響為了明確低氧是否通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變來(lái)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移，我們使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響。細(xì)胞處理48 h后，常氧/高氧誘導(dǎo)的COLO205細(xì)胞較低氧組顯示出減弱的遷移能力（圖2）。這說(shuō)明低氧誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變后，可以相應(yīng)地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移能力，而常氧/高氧反轉(zhuǎn)EMT后相應(yīng)地降低其遷移能力。

2.3氧濃度對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力影響我們利用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)來(lái)研究低氧誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變后是否對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲的能力有影響。其結(jié)果顯示，低氧組細(xì)胞穿過(guò)薄膜的數(shù)目較常氧/高氧組明顯增多（圖3）。提示低氧誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT可以相應(yīng)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，而常氧/高氧反轉(zhuǎn)EMT相應(yīng)降低其侵襲能力。

圖3 不同氧濃度下結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力變化（×200）：A為低氧組；B為常氧組；C為高氧組

3 討論

EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中提高細(xì)胞遷移及侵襲能力，助其突破基膜，并促進(jìn)血管內(nèi)滲幫助其進(jìn)入循環(huán)，形成 CTCs［10-11］。腫瘤細(xì)胞發(fā)生 EMT，不但促進(jìn)CTCs產(chǎn)生，還可幫助CTCs存活，為CTCs通過(guò)MET形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶打下基礎(chǔ)［12］。目前EMT-MET時(shí)空調(diào)控的確切機(jī)制尚不明確。在此研究中我們證實(shí)腫瘤原發(fā)處低氧微環(huán)境可調(diào)控細(xì)胞EMT發(fā)生，上調(diào)Vimentin表達(dá)，下調(diào)E-cadherin表達(dá)，并且增強(qiáng)侵襲能力，而常氧/高氧環(huán)境下則發(fā)生相反的現(xiàn)象。此結(jié)果證實(shí)我們的假說(shuō)，即已習(xí)慣乏營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下生存的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入歸巢富氧微環(huán)境后，失去低氧誘導(dǎo)，迫使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT-MET轉(zhuǎn)換，形成新的轉(zhuǎn)移灶，一旦腫瘤在空間上生長(zhǎng)到一定體積后，又建立新的乏氧微環(huán)境，再次形成新的惡性循環(huán)，以此方式不停的促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

實(shí)體腫瘤局部微環(huán)境最顯著的特點(diǎn)是缺氧。已經(jīng)證實(shí)結(jié)腸癌中存在明顯的缺氧狀態(tài)，其缺氧程度甚至比其他實(shí)體腫瘤更嚴(yán)重。這種缺氧環(huán)境與腫瘤侵襲特征密切相關(guān)［13］。低氧的腫瘤微環(huán)境下腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為更趨向惡性，更具侵襲性，并治療的表現(xiàn)強(qiáng)抵抗性。在缺氧可以影響腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)可塑性，誘導(dǎo)EMT發(fā)生［14］。Cano等［15］通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧通過(guò)HIF-1α上調(diào)Slug的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。我們的研究結(jié)果和上述結(jié)果一致，也再次證實(shí)了此結(jié)論。在此基礎(chǔ)上本次試驗(yàn)繼續(xù)在富氧環(huán)境下觀察到MET現(xiàn)象，這是本研究閃亮點(diǎn)。提示氧濃度的差異在腫瘤轉(zhuǎn)移的不同階段，EMT和MET之間轉(zhuǎn)換具有重要作用。這種原發(fā)灶低氧環(huán)境和歸巢部位富氧環(huán)境的差異有可能是EMT-MET轉(zhuǎn)換的新視角。更深入的機(jī)制研究仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

在腫瘤轉(zhuǎn)移播散的過(guò)程中，EMT可賦予腫瘤細(xì)胞新特性，這主要包括增加細(xì)胞遷移和侵襲能力，使其突破基膜，并通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)滲幫助腫瘤細(xì)胞播散進(jìn)入循環(huán)，形成CTCs。Thiery［16］等發(fā)生EMT的細(xì)胞與未發(fā)生EMT的細(xì)胞均可以形成腫瘤，但只有前者侵入相鄰組織和血管，提示癌細(xì)胞發(fā)生EMT是產(chǎn)生CTCs的必要條件。播散到遠(yuǎn)處CTCs適應(yīng)周?chē)|(zhì)環(huán)境后，還會(huì)再經(jīng)歷一個(gè)MET轉(zhuǎn)換，重新獲得增殖特性，進(jìn)而形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶［17］。目前研究這種可逆并且瞬時(shí)的EMT-MET轉(zhuǎn)換將是一個(gè)重要科研方向。作為一個(gè)新的研究領(lǐng)域，無(wú)疑有大量未知問(wèn)題亟待解決。顯然，深入研究CTCs-EMT產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化的機(jī)制及其生物學(xué)意義必將有助于揭開(kāi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移之謎，并且可為制定新的腫瘤靶向治療策略提供依據(jù)。

總之，上皮腫瘤細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)一個(gè)動(dòng)態(tài)EMT/MET過(guò)程才能形成微轉(zhuǎn)移，這其中微環(huán)境氧濃度的差異發(fā)揮作用，針對(duì)EMT逆轉(zhuǎn)過(guò)程可能成為阻止腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)的新途徑。在不久的將來(lái)，加強(qiáng)我們對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中EMT/MET動(dòng)態(tài)過(guò)程分子調(diào)控的理解可以為我們提供更有效的手段去根除腫瘤轉(zhuǎn)移。（本文圖1～3見(jiàn)插圖9-2）