鄒志明，鄒海霞，張 煥，李紹波，王 鑫，歐陽解秀

(南昌大學 生命科學學院，江西 南昌 330031)

組蛋白去乙?；?Histone deacetylase, HDAC)通過去乙酰化作用移除染色質組蛋白上的乙?；?，導致染色質濃縮并抑制基因表達[1]。目前，植物中的HDAC可分為4個家族，即RPD3家族、HDA1家族、SIR2家族和HD2家族，其中HD2蛋白是植物特有的HDAC成員[2-3]。近年來，HD2家族成員的功能得到了深入研究。研究表明，擬南芥中有4個成員，分別是HD2A(HDT1)、HD2B(HDT2)、HD2C(HDT3)和HD2D(HDT4)。AtHD2A、AtHD2B和AtHD2C能夠調控轉錄抑制，其中，在擬南芥中，下調表達AtHD2A導致種子產量降低[4-5]；AtHD2C與脫落酸(ABA)、鹽、干旱等脅迫反應相關[6-7]。Fu等[8]在水稻中發(fā)現(xiàn)HD2基因家族至少有2個成員，分別是OsHDT701和OsHDT702。下調表達OsHDT702水稻植株的葉片嚴重變窄，表明OsHDT702可能參與細胞分裂或增殖[7]。OsHDT701通過降低組蛋白H4乙?；虶A合成相關基因的表達，影響水稻種子萌發(fā)，過表達OsHDT701可以提高植株對高鹽和干旱的耐受性[9]。Ding等[10]研究發(fā)現(xiàn)，OsHDT701通過調節(jié)PRR和防衛(wèi)相關蛋白的組氨酸H4乙酰化，負向調控水稻的天然免疫。這就表明植物HDACs廣泛參與植物的生長發(fā)育及逆境響應過程，對水稻的HD2家族基因深入研究有重要的意義[11]。

選擇性剪接又稱為可變剪接(Alternative splicing，AS)，是指一個基因的轉錄產物在不同的生長發(fā)育階段、特異的組織器官和外界環(huán)境影響下，通過不同的剪接方式，可以得到不同的mRNA和蛋白質產物，這種現(xiàn)象是導致基因功能多樣性的重要原因之一[12]。可變剪接事件廣泛存在于真核生物基因表達過程中,調節(jié)植物的70%基因的外顯子[13-14]。一些研究表明，植物通過可變剪接來調節(jié)其生理和新陳代謝，從而在正常和壓力條件下保持體內穩(wěn)態(tài)，包括寒冷、干旱、高溫、高鹽度和病原體感染[15-18]?？勺兗艚涌梢酝ㄟ^調節(jié)細胞內基因的表達，在植物的生長發(fā)育、生理代謝、生物和非生物脅迫等過程中發(fā)揮調控作用[19-20]。例如，擬南芥開花自主途徑中FCA(Flowering time control protein)基因通過可變剪接產生4種轉錄本，并通過對轉錄本的表達量調控來完成自身的負調控表達，最終影響開花時間[21]。

在Phytozome網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲得了水稻HD2基因家族的另一成員OsHDT703(LOC_Os01g68160)，該基因的克隆、表達特性和生物學功能分析等尚未見報道，有待進一步研究。本研究中，依據Phytozome網站數(shù)據庫資源，首先利用生物信息學分析了該基因的結構特點和蛋白進化關系，并發(fā)現(xiàn)OsHDT703基因可能存在多種不同的可變剪接表達產物，進而以粳稻中花11為材料，設計各種可變剪接體的特異引物，通過RT-PCR對不同剪接體進行擴增，經TA克隆后進行測序分析，以確定OsHDT703真實存在的可變剪切體，為后續(xù)深入研究該基因在水稻生長發(fā)育、生理代謝、生物和非生物脅迫等過程中可能具有的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

試驗材料為粳稻中花11(ZH11)的葉片和幼穗。

1.2 質粒和菌株

用于TA克隆的pMD18-T(TaKaRa)載體，大腸桿菌菌株DH5α。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取以及cDNA第一鏈合成 本試驗參照吳蔚蔚等[22]的方法，采用液氮對水稻葉片和幼穗進行研磨，用TRIzol法抽提水稻葉片和幼穗的總RNA，并按照TIANGEN的TIANscriptⅡRT kit cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.3.2OsHDT703不同剪接體分析和引物設計 Phytozome網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)的數(shù)據庫資源表明，OsHDT703可能存在5種不同的剪接體(表1)，分別編號為1～5號可變剪接體，根據這些可變剪接體的序列特征，設計了可變剪接體的RT-PCR特異引物(表2)。其中LOC_Os01g68160.3和LOC_Os01g68160.4的CDS序列一樣，其蛋白序列也就相同，故未設計區(qū)分這2個可變剪接體的特異引物。不同引物所在的位置如圖1所示。

表1 水稻OsHDT703基因可能存在的5種可變剪接體Tab.1 Five putative splice variants of rice OsHDT703 gene

1.3.3 RT-PCR擴增和目的片段割膠純化回收 以葉片/幼穗cDNA為模板，利用TransTaq HiFi DNA Polymerase酶和表2中的引物對進行OsHDT703基因的可變剪接體RT-PCR擴增，電泳后割膠純化回收獲得預期大小的PCR產物，用于后續(xù)的TA克隆試驗。

1.3.4 TA克隆 利用TaKaRa公司的pMD18-T Vector Cloning kit 試劑盒，將純化的目的片段連接到pMD18-T載體，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆后做菌液PCR鑒定，隨后進行測序檢測和序列比對分析。

表2 引物與PCR擴增產物信息Tab.2 Information of primers and PCR product

1.3.5 OsHDT703蛋白進化分析 基于上述獲得的OsHDT703的可變剪接體對應的蛋白序列以及NCBI數(shù)據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中擬南芥、水稻、大豆、玉米、小麥、大麥、茄屬植物等的一些HD2家族蛋白序列，利用ClustalX軟件，參考Wang等[23]的方法，分析水稻OsHDT703蛋白的進化關系。

2 結果與分析

2.1 OsHDT703基因的可變剪接體及其RT-PCR特異引物位置

Phytozome網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)上的數(shù)據庫資源顯示，OsHDT703可能存在5種不同的剪接體(圖1)，1～5號可變剪接體分別代表了LOC_Os01g68160.1、LOC_Os01g68160.2、LOC_Os01g68160.3、LOC_Os01g68160.4和LOC_Os01g68160.5，其中2號剪切體的mRNA比1號剪切體多了20 bp序列(即CACTTGCTAACTT GCTCAGG)，3和4號剪接體的CDS序列完全相同，比5號剪接體多了27 bp序列(即GTATTCGTCTAT ACCCCAAGTTAGATG)。根據這些可變剪接體序列，設計了其RT-PCR擴增的特異引物，在剪接體上的位置見圖1。

1～5分別為剪接體LOC_Os01g68160.1、LOC_Os01g68160.2、LOC_Os01g68160.3、LOC_Os01g68160.4和LOC_Os01g68160.5。1-5 represent splice variants LOC_Os01g68160.1, LOC_Os01g68160.2, LOC_Os01g68160.3, LOC_Os01g68160.4 and LOC_Os01g68160.5.

2.2 OsHDT703基因可變剪接體的克隆

首先，以ZH11的cDNA為模板，采用引物mF/m12R和CDSF/CDS345R分別做PCR擴增，得到預期的條帶(圖2-A)，分別約為1 322/1 342 bp和717/690 bp，初步說明圖2-A中泳道1的條帶可能包含1和/或2號剪切體，泳道2的條帶可能包含3/4和/或5號剪接體。然后分別以上述mF/m12R和CDSF/CDS345R的PCR產物為模板，利用mF/m2R和CDSF/CDS5R引物對進行RT-PCR擴增，獲得了預期的PCR產物(圖2-B)，圖2-B中泳道1為引物mF/m2R的擴增條帶，與預期的1 131 bp大小基本一致，初步說明2號剪接體的存在，泳道2為CDSF/CDS5R的擴增條帶，與預期的376 bp大小接近，初步說明5號剪接體的存在。

A： M.Marker；1.引物mF/m12R擴增條帶； 2.引物CDSF/CDS345R擴增條帶。B：M.Marker；1.引物mF/m2R擴增條帶； 2.引物CDSF/CDS5R擴增條帶。A：M.Marker; 1.mF/m12R; 2.CDSF/CDS345R. B:M.Marker; 1.mF/m2R; 2.CDSF/CDS5R.

為了進一步確定OsHDT703剪接體的真實存在，將上述引物對mF/m12R和CDSF/CDS345R的PCR擴增電泳條帶進行割膠，按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行PCR產物的純化回收，將純化回收得到的產物連接到pMD18-T載體，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，再用基因特異性引物進行菌落PCR鑒定陽性單菌落，部分菌落PCR結果如圖3所示。

A： 1號剪接體菌落PCR鑒定結果；M.Marker；1-6.單菌落；B：3/4號剪接體菌落PCR鑒定結果；M.Marker；1-3.單菌落。A： Results of colony PCR for No.1 splice variant; M.Marker；1-6.Single colonies；B:Results of colony PCR for No.3/4 splice variant; M.Marker；1-3.Single colonies.

A.1號剪接體序列比對；B.2號剪接體序列比對；C.3/4號剪接體序列比對；D.5號剪接體序列比對。A.Sequence alignment of No.1 splice variant; B.Sequence alignment of No. 2 splice variant; C. Sequence alignment of No.3/4 splice variant; D.Sequence alignment of No.5 splice variant.

2.3 OsHDT703基因不同剪接體的測序結果分析

挑選上述若干單克隆陽性菌落搖菌，提取質粒送北京擎科新業(yè)生物科技公司進行測序，測序結果在NCBI上進行Blast分析，比對結果如圖4。其中，圖4-A-B顯示引物對mF/m12R擴增到的產物中分別有1和2號剪切體的存在；圖4-C-D顯示引物對CDSF/CDS345R擴增到的產物中分別有3、4和5號剪切體的存在。3號剪切體和4號剪接體CDS序列完全相同，未能區(qū)分，可能存在一種或者二者均存在。至此，結果顯示，OsHDT703基因預測的5種可變剪接體中，至少存在4種不同的可變剪接體。

2.4 OsHDT703蛋白的結構與進化分析

從Phytozome數(shù)據庫中下載OsHDT701、OsHDT702和OsHDT703蛋白序列，對蛋白序列進行序列分析發(fā)現(xiàn)，蛋白N端均具有NPL保守結構域(圖5)，說明鑒定到的OsHDT703蛋白為水稻HD2家族成員。

圖5 OsHDT703蛋白的結構分析Fig.5 Protein sequence analysis of OsHDT703

通過Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)網站獲知，OsHDT703基因主要編碼1個由320個氨基酸組成的蛋白質，借助NCBI數(shù)據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的蛋白質序列分析，選取來源于擬南芥、水稻、大豆、玉米、小麥、大麥、茄屬植物等共16個蛋白，用于分析OsHDT703蛋白的進化關系，采用ClustalX(Version 2.0)軟件和MEGA 7進行序列比對，構建了無根進化樹(圖6)。結果顯示， 水稻OsHDT703蛋白與水稻另一個HD2家族蛋白OsHDT702以及大麥中的一個HD2家族蛋白處于同一分支，親緣關系較近；但是水稻OsHDT701蛋白與玉米中的HD2蛋白、小麥和大麥中的HD2蛋白關系較近，說明水稻中HD2蛋白的功能可能存在一定的分化。

3 討論

Fu等[8]在水稻中已報道了2個HD2基因家族成員，分別是OsHDT701和OsHDT702，其編碼的蛋白質具有NPL結構域。基于Phytozome網站數(shù)據庫資源，本研究利用RT-PCR、TA克隆和測序等方法克隆了尚未見功能報道的OsHDT703基因的可變剪接體，其編碼的蛋白序列N端含有NPL結構域，說明OsHDT703屬于HD2蛋白家族成員。

選擇來源于7個物種的16個蛋白構建Neighbor joining樹，At.擬南芥; Os.水稻; Hv.大麥; Zm.玉米; Ta.小麥；Gm.大豆；Sc.茄屬植物。There were 16 genes chosen from different common species like At. Arabidopsis thaliana; Os.Oryza sativa; Hv.Hordeum vulgare; Zm.Zea mays; Ta.Triticum aestivum; Gm.Glycine max; Sc.Solanum chacoense.

同一家族基因常常具有類似功能，也存在一定的分化。在擬南芥中，下調表達AtHD2A導致種子產量降低[5]；AtHD2C與脫落酸(ABA)、鹽、干旱等脅迫反應相關[6-7]，說明HD2家族成員的功能具有一定的分化。通過蛋白進化分析結果顯示，水稻OsHDT703與水稻中另一個HD2家族基因OsHDT702以及大麥中的一個HD2家族基因較近；而水稻OsHDT701蛋白與玉米中的另外3個蛋白、大麥和小麥中的HD2蛋白關系較近，說明水稻中HD2蛋白的功能可能存在一定的分化。研究表明，OsHDT702可能通過參與細胞分裂或增殖來調控水稻植株葉片的寬度[7]。水稻OsHDT703蛋白與水稻中另一個HD2家族蛋白OsHDT702處于同一分支，可能具有類似功能，尚需進一步驗證。

可變剪接事件廣泛存在于真核生物基因表達過程中[13]，發(fā)生于參與表達調控過程的基因，如信號傳導通路[13]及程序性死亡[15]相關基因。在擬南芥中，通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)了數(shù)萬種AS，可能參與到非生物脅迫、器官發(fā)育和細胞分化等過程[24-25]。擬南芥開花自主途徑中FCA(Flowering time control protein)基因通過可變剪接產生4種轉錄本，并通過對轉錄本的表達量調控來完成自身的負調控表達，最終影響開花時間[19]。水稻NAL1基因的可變剪切調控水稻旗葉寬主效QTL(qFLW4)，進而影響葉綠素含量和劍葉大小[26]。Phytozome網站數(shù)據顯示OsHDT703存在5種可變剪接，本研究確認了OsHDT703基因至少有4種不同可變剪接體。前人研究結果已經表明，擬南芥、水稻等植物中HD2家族基因廣泛參與植物的生物和非生物脅迫的調控[7-9]。OsHDT703基因可能通過不同可變剪接體參與植物的生長發(fā)育及對逆境的響應過程中。水稻OsHDT703基因可變剪接體的驗證結果為進一步研究水稻OsHDT703基因的功能奠定基礎，為后續(xù)的試驗研究提供了理論依據。