李春燕，張翠綿,柴建芳，秘彩莉，馬秀英，趙 和，呂孟雨，周 碩，董福雙，劉永偉，楊 帆，王海波

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北 石家莊 050051；2.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

麥谷蛋白由高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)通過分子間二硫鍵聚合而成[1],HMW-GS對面包的加工品質(zhì)有重要影響[2-4],分析HMW-GS組成已成為品質(zhì)育種中親本選配和雜交后代選擇的重要依據(jù)，LMW-GS對小麥加工品質(zhì)也有不可忽視的作用，不僅影響小麥面團(tuán)的延展性和穩(wěn)定性[5-6],對面筋的強(qiáng)度也有明顯的影響[7-9]，因此，同時鑒定小麥的高低分子量麥谷蛋白亞基組成對研究小麥品質(zhì)具有重要意義。

SDS-PAGE是分離小麥高低分子量麥谷蛋白亞基的常用方法，但根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康牡牟煌邴湽鹊鞍讟悠返闹苽渖峡煞譃?種主要類型：一種是側(cè)重定性分析，要求制備的麥谷蛋白樣品純度比較高，Singh等[10]報道的方法是這類方法的代表，典型特征是用50%的異丙醇去除單體蛋白，孫輝等[11]曾對這類方法制備的麥谷蛋白樣品進(jìn)行過樣品濃縮方面的優(yōu)化；另一種是側(cè)重定量分析，要求在制備麥谷蛋白樣品過程中不損失麥谷蛋白，這種類型的典型代表是Fu和Kovacs[12]報道的方法，典型特征是用0.3 mol/L的NaI和7.5%異丙醇混合溶液去除單體蛋白，紀(jì)軍等[13]和覃建兵等[14]曾以該方法為基礎(chǔ)進(jìn)行不同方面的優(yōu)化。這2種樣品制備方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，第2種方法在去除單體蛋白的過程中為避免去除麥谷蛋白，在制備的麥谷蛋白樣品中含有少量的單體蛋白，第1種方法在去除單體蛋白的過程中雖然會去除一部分麥谷蛋白，但最后制備的麥谷蛋白樣品純度很高[12]，從目前使用情況來看，Singh等[10]的方法在國內(nèi)外應(yīng)用更為廣泛[15-19]，但筆者發(fā)現(xiàn)該方法中單體蛋白去除和麥谷蛋白還原過程有些環(huán)節(jié)和因素仍需改進(jìn)，本研究主要針對這一問題以及麥谷蛋白烷化處理的簡化問題開展深入研究。

1 材料和方法

1.1 供試小麥品種

科農(nóng)199、濟(jì)麥22、師欒02-1和煙農(nóng)19。

1.2 提取液母液

A1: 50%異丙醇(異丙醇由天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))；A2：30%異丙醇；B1: 10%異丙醇+0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)(Tris為Amresco產(chǎn)品)；B2: 15%異丙醇+0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；B3: 20%異丙醇+0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；B4: 25%異丙醇+0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；B5: 30%異丙醇+0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；B6: 35%異丙醇+0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；B7: 50%異丙醇+0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)；C：樣品緩沖液 0.08 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)+2%SDS(SDS為Biotopped產(chǎn)品)+ 40%甘油(甘油為上海生工產(chǎn)品)+0.02%溴酚藍(lán)(溴酚藍(lán)為上海生工產(chǎn)品)。

1.3 Singh等的麥谷蛋白提取方法

醇溶蛋白的去除：取單粒小麥種子用電動粉碎器(型號為WD9419，由北京市六一儀器廠生產(chǎn))磨成粉或取20 mg面粉置于2 mL離心管中, 加1 mL提取液A1，渦旋混勻后65 ℃水浴提取30 min, 水浴其間至少再混勻2次以便充分提取, 12 000 r/min離心1 min, 棄上清,重復(fù)提取1次，沉淀用移液槍頭挑起后容易混勻，經(jīng)過2次提取后的沉淀再用0.5 mL的提取液A1洗一次, 12 000 r/min離心5 min, 棄上清,沉淀用于下一步試驗(yàn)。

麥谷蛋白的還原：向上述沉淀中加入100 μL含1%DDT(m/V)(DTT為上海生工產(chǎn)品)的提取液B7, 渦旋混勻后在65 ℃水浴提取30 min, 12 000 r/min離心5 min。

麥谷蛋白亞基的烷化：向上述還原的麥谷蛋白溶液中加入100 μL含1.4% 4-VP(4-VP為索萊寶產(chǎn)品)的提取液B7, 65 ℃水浴處理15 min, 12 000 r/min離心2 min。

烷化的麥谷蛋白亞基與樣品緩沖液的混合：取上述烷化處理后的上清100 μL加到含100 μL溶液C的離心管中，簡單渦旋后65 ℃水浴處理15 min, 12 000 r/min離心2 min，取10 μL或20 μL上清進(jìn)行下一步的SDS-PAGE電泳(丙烯酰胺為上海生工產(chǎn)品；甲叉雙丙烯酰胺為Sigma產(chǎn)品)。

1.4 增設(shè)的麥谷蛋白提取方法

在醇溶蛋白去除環(huán)節(jié)，異丙醇濃度設(shè)50%(對照)和30% 2種處理；在麥谷蛋白的還原環(huán)節(jié)，設(shè)10%，15%，20%，25%，30%，35%和50% 6種異丙醇濃度處理，即分別用加有1%DTT的提取液母液B1-B6進(jìn)行麥谷蛋白的還原處理；在麥谷蛋白亞基的烷化環(huán)節(jié)，麥谷蛋白還原后不直接進(jìn)行烷化處理，而是把烷化劑4-VP直接加到樣品緩沖液C中，在麥谷蛋白亞基提取液與樣品緩沖液混合過程中同時進(jìn)行烷化，4-VP在樣品緩沖液中的濃度分別設(shè)1.4%，1.0%和0.6% 3種處理，操作時取50 μL經(jīng)過還原處理的上清液分別加到50 μL含不同4-VP濃度的樣品緩沖液C中，簡單渦旋后65 ℃水浴處理15 min。通過優(yōu)化處理與Singh等方法進(jìn)行比較，明確優(yōu)化處理的優(yōu)缺點(diǎn)。

1.5 SDS-PAGE電泳

電泳槽型號JY-SCZ9，玻璃板規(guī)格14 cm×16 cm，由北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)，采用SDS不連續(xù)緩沖系統(tǒng), 分離膠緩沖液為0.375 mol/L Tris-HCI, pH值8.8，0.1% SDS,分離膠濃度10%，濃縮膠緩沖液為0.125 mol/L Tris-HCI,pH值6.8,0.1% SDS，濃縮膠濃度4.8%，分離膠和濃縮膠交聯(lián)度均為2.6%，電極緩沖液0.025 mol/L Tris-HCI,pH值8.3，0.192 mol/L甘氨酸(甘氨酸為上海生工產(chǎn)品)，0.1% SDS，每孔上樣量10～20 μL，22 ℃循環(huán)水浴,電流20 mA, 電泳約5.5 h。電泳結(jié)束后,凝膠在染色液(10%三氯乙酸，0.05%考馬斯亮藍(lán)R-250)中染色, 在脫色液(10%乙醇, 8%乙酸)中脫色至背景清晰(三氯乙酸由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，考馬斯亮藍(lán)R-250為索萊寶產(chǎn)品，乙醇和乙酸為天津永大產(chǎn)品)。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥谷蛋白還原步驟異丙醇濃度對麥谷蛋白提取效果的影響

以科農(nóng)199為試材，比較了麥谷蛋白還原步驟不同異丙醇濃度對麥谷蛋白亞基提取效果的影響，從圖1可以看出，在10%～50%的異丙醇濃度范圍內(nèi)，高分子量麥谷蛋白亞基的溶解性沒有明顯差別，而低分子量麥谷蛋白亞基的溶解性卻差別很大，異丙醇濃度低時，低分子量麥谷蛋白的溶解性也很低，隨著異丙醇濃度提高，低分子量麥谷蛋白的溶解性也逐漸提高，異丙醇濃度達(dá)到30%時，溶解性達(dá)到最大，之后溶解性維持在最大水平，說明麥谷蛋白還原溶液中異丙醇濃度由50%降到30%，對小麥高低分子量麥谷蛋白亞基的提取效果沒有影響，但異丙醇濃度繼續(xù)降低就會影響低分子量麥谷蛋白的提取效果。

1.10%；2.15%；3.20%；4.25%；5.30%；6.35%；7.50%。

2.2 單體蛋白去除步驟異丙醇濃度對麥谷蛋白提取效果的影響

以科農(nóng)199為試材，進(jìn)一步對50%和30% 2種異丙醇濃度去除單體蛋白的效果進(jìn)行了比較，從圖2可以看出，用50%的異丙醇去除單體蛋白和用30%的異丙醇去除單體蛋白最后提取的麥谷蛋白效果沒有差別。

A.50%異丙醇；B.30%異丙醇。A. 50% isopropanol；B.30% isopropanol.

2.3 烷化劑4-VP直接加到樣品緩沖液中進(jìn)行烷化對麥谷蛋白分離效果的影響

把烷化劑4-VP直接加到樣品緩沖液中進(jìn)行烷化，3種4-VP濃度的烷化效果沒有明顯差別，但不同烷化劑濃度對電泳背景卻有明顯影響(圖3)，當(dāng)烷化劑濃度為1.4%時，泳道的背景比較深，尤其是上樣量為20 μL時，而當(dāng)烷化劑濃度降為1.0%和0.6%時，背景恢復(fù)正常，烷化效果并沒有因濃度降低而受影響。另外，從圖3還可以看出，提取步驟簡化后，電泳條帶的強(qiáng)度提高了1倍，10 μL的上樣量(圖中的A2、A3和A4)與原方法中20 μL的上樣量(圖3中B1)條帶強(qiáng)度相當(dāng)。

1.對照；2.1.4% 4-VP；3.1.0% 4-VP；4.0.6% 4-VP；A.上樣量10 μL；B.上樣量20 μL。1. Control; 2. 1.4% 4-VP; 3.1.0% 4-VP; 4.0.6% 4-VP; A.Sample loading 10 μL; B.Sample loading 20 μL.

2.4 優(yōu)化程序的應(yīng)用

優(yōu)化程序?yàn)樵谌コ龁误w蛋白和麥谷蛋白還原的步驟中，異丙醇濃度由原來的50%下調(diào)到30%，在麥谷蛋白亞基烷化方面，去除單獨(dú)的烷化步驟，把烷化劑4-VP直接加到樣品緩沖液中進(jìn)行烷化，烷化劑濃度由原來的1.4%降為0.6%。優(yōu)化程序在4個小麥品種上進(jìn)行了應(yīng)用，小麥品種師欒02-1和煙農(nóng)19為強(qiáng)筋小麥，濟(jì)麥22和科農(nóng)199為中筋小麥，從圖4可以看出，優(yōu)化程序在這4個小麥品種上應(yīng)用效果良好。

1.煙農(nóng)19；2.科農(nóng)199；3.濟(jì)麥22；4.師欒02-1。1.Yannong 19; 2.Kenong 199; 3.Jimai 22; 4.Shiluan 02-1.

3 討論與結(jié)論

在Singh等[10]的方法中，麥谷蛋白還原時采用的異丙醇濃度為50%，但對于為什么采用此濃度，從文獻(xiàn)中沒有找到答案，在50%異丙醇中呈溶解狀態(tài)的小麥麥谷蛋白，在70%異丙醇中高分子量麥谷蛋白就會沉淀下來，而低分子量麥谷蛋白仍呈溶解狀態(tài)[20]，說明小麥高低分子量麥谷蛋白在高濃度異丙醇溶液中溶解性并不相同，但在異丙醇濃度低于50%時，小麥高低分子量麥谷蛋白的溶解性將如何變化尚未見報道，通過試驗(yàn)，明確了在30%～50%的異丙醇濃度范圍內(nèi)，小麥高低分子量麥谷蛋白的溶解性沒有明顯差別，異丙醇濃度低于30%以后繼續(xù)下降到10%，低分子量麥谷蛋白的溶解性逐漸變差，而高分子量麥谷蛋白亞基的溶解性差別仍不明顯，這一發(fā)現(xiàn)以前未見報道，根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)化程序中，異丙醇濃度由原來的50%降到了30%，另外，該發(fā)現(xiàn)還顯示，在麥谷蛋白還原過程中，采用低濃度異丙醇(10%甚至更低)可以分離出純度較高的高分子量麥谷蛋白亞基，在只需要鑒定高分子量麥谷蛋白亞基組成時，可有效減少低分子量麥谷蛋白亞基的干擾。

在Singh等[10]的方法中，去除單體蛋白時采用的異丙醇濃度也是50%，為明確該濃度能否降低，進(jìn)一步對50%異丙醇和30%異丙醇去除單體蛋白的效果進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)2種濃度的作用效果沒有明顯差別，為此，在優(yōu)化程序中，把單體蛋白去除步驟中使用的異丙醇濃度也由50%下調(diào)到了30%。

在Singh等[10]的方法中，麥谷蛋白亞基的烷化是單獨(dú)的一步，能否把烷化劑直接加到上樣緩沖液中進(jìn)行烷化，關(guān)鍵是要明確烷化效果是否會受影響，通常情況下人們可能認(rèn)為上樣緩沖液中較高濃度的甘油會影響烷化的效果，通過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)烷化劑直接加到上樣緩沖液中烷化效果并未受到不良影響，但原烷化劑濃度對電泳背景有明顯不良影響，通過降低烷化劑濃度有效解決了電泳背景問題，需要注意的是，使用1.0%的烷化劑濃度多數(shù)情況下不會加重電泳背景，但有時會由于操作誤差產(chǎn)生一些弱的背景，而采用0.6%的烷化濃度，均沒有產(chǎn)生背景，為保險起見，推薦使用0.6%的烷化劑濃度。關(guān)于烷化劑濃度對烷化效果的影響，孫輝等[11]曾對更大濃度范圍(0.01%，0.1%，1.4%，2.8%和14%)的4-VP處理進(jìn)行過烷化效果比較，除0.01%的濃度處理烷化效果較差外，其他濃度處理烷化效果均沒有明顯差別，這與本研究的結(jié)果是一致的，該研究中高濃度烷化劑處理沒有增加電泳背景是由于烷化處理后的麥谷蛋白又用丙酮進(jìn)行了沉淀，去除了烷化劑對電泳背景的影響。在Singh等[10]的方法中，1.4%的烷化濃度沒有產(chǎn)生較深的電泳背景，是由于還原后的麥谷蛋白溶液與等量的烷化溶液混合時烷化劑濃度稀釋了1倍，之后與上樣緩沖液等量混合時又稀釋了一倍，最終的烷化劑濃度只有0.35%。

本研究針對影響小麥麥谷蛋白亞基分離的幾個關(guān)鍵因素展開了研究，并在此基礎(chǔ)上對分離方法進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化方法在單體蛋白去除和麥谷蛋白還原步驟中，把異丙醇濃度由原來的50%下調(diào)到了30%，在麥谷蛋白亞基烷化方面，省去了單獨(dú)的烷化步驟，把烷化劑4-VP直接加到樣品緩沖液中進(jìn)行烷化，烷化劑濃度由原來的1.4%降為0.6%。優(yōu)化后的麥谷蛋白亞基分離程序，在不影響分離效果的前提下，不但降低了藥品用量，簡化了提取步驟，而且提高了電泳條帶的強(qiáng)度。