吳青，楊云玲，林燕玲，林坦

[1.浙江省人民醫(yī)院（杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院） 婦科，浙江 杭州 310014；2.福建省立醫(yī)院（福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院） 婦產(chǎn)科，福建 福州 350001]

子宮腺肌瘤是有活性內(nèi)膜侵入子宮肌層局限生長(zhǎng)，伴周圍肌層代償性增生肥大，臨床多以漸進(jìn)性痛經(jīng)、經(jīng)量增多和不孕等就診；可能影響子宮內(nèi)膜容受性[1-2]，并且子宮腺肌病患者妊娠還容易發(fā)生早產(chǎn)、胎膜早破和妊娠期高血壓等[3]。對(duì)有生育需求的患者，促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）是治療子宮腺肌病的主要藥物，但部分患者效果不佳，或停藥后快速?gòu)?fù)發(fā)和進(jìn)展。子宮腺肌病病灶切除術(shù)可快速去除病灶，亦有術(shù)后順利妊娠分娩的病例[4]。術(shù)后聯(lián)合GnRH-a及曼月樂(lè)可維持療效，降低復(fù)發(fā)率，有利于術(shù)后長(zhǎng)期管理。

HOX基因?qū)儆诙嗷蚣易宓霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，其蛋白產(chǎn)物通過(guò)與DNA結(jié)合激活或抑制目的基因，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，介導(dǎo)子宮內(nèi)膜容受性的形成，已證實(shí)HOXA10基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜容受性和著床是必需的[5]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)最主要的一種修飾方式，HOXA10基因是受DNA甲基化調(diào)控的基因之一，可能與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病和不孕有關(guān)。2005年有研究[6]報(bào)道發(fā)現(xiàn)了HOXA10基因啟動(dòng)子的3個(gè)甲基化區(qū)域（F1、F2、F3），且盆腔子宮內(nèi)膜異位癥影響HOXA10基因甲基化，進(jìn)而降低子宮內(nèi)膜HOXA10基因表達(dá)。后續(xù)研究[7]提示，在HOXA10基因啟動(dòng)子的3個(gè)甲基化區(qū)域中，F(xiàn)1片段與HOXA10基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控最密切。

目前，對(duì)子宮腺肌病內(nèi)膜HOXA10基因表達(dá)情況及其甲基化水平知之甚少。本研究從子宮內(nèi)膜容受性角度，分析腹腔鏡子宮腺肌瘤切除術(shù)后聯(lián)合GnRH-a和曼月樂(lè)綜合治療的效果，及其對(duì)種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10-mRNA水平的影響和基因啟動(dòng)子F1甲基化程度，探討子宮腺肌病對(duì)內(nèi)膜容受性的影響機(jī)制，研究改善子宮腺肌瘤患者子宮內(nèi)膜容受性的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年6月－2016年6月就診于福建省立醫(yī)院婦科的子宮腺肌瘤77例作為觀察組，年齡（40.5±2.3）歲。觀察組月經(jīng)過(guò)多和痛經(jīng)的患者45例，僅月經(jīng)過(guò)多者17例，僅痛經(jīng)者15例，CA125為（109.0±62.3）u/ml。同期因卵巢畸胎瘤、輸卵管系膜囊腫就診的月經(jīng)規(guī)則、已生育患者24例作為對(duì)照組，平均年齡（39.9±3.3）歲。兩組患者年齡無(wú)明顯差異（P=0.457）。

觀察組所有患者均有漸進(jìn)性痛經(jīng)和/或月經(jīng)增多表現(xiàn)；CA125升高；彩超提示子宮肌層回聲不均、子宮腺肌瘤（肌壁間）≥4 cm；且術(shù)后均經(jīng)過(guò)病理檢查結(jié)果證實(shí)；排除有嚴(yán)重感染、心血管疾病和婦科其他疾病的患者，排除手術(shù)禁忌的患者。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患者均知情同意，愿意參與本試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 觀察組觀察組患者均采用尿促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）排卵試條（潤(rùn)和生物醫(yī)藥科技有限公司）監(jiān)測(cè)排卵，于陽(yáng)性后第7天黃體中期使用一次性宮腔組織吸引管（上海家寶醫(yī)學(xué)保健科技有限公司）收集子宮內(nèi)膜，并行腹腔鏡子宮腺肌瘤切除術(shù)，術(shù)后所有患者均皮下注射諾雷得（醋酸戈舍瑞林緩釋劑，Astra Zeneca）3.6 mg，連續(xù)治療6個(gè)月后，宮內(nèi)放置曼月樂(lè)（左炔諾孕酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)，LNGIUS）。患者因有生育要求或點(diǎn)滴陰道出血不愿繼續(xù)放置，12個(gè)月后取出曼月樂(lè)，取出曼月樂(lè)后同法監(jiān)測(cè)排卵并收集子宮內(nèi)膜。

1.2.2 對(duì)照組采用尿LH排卵試條監(jiān)測(cè)排卵，于陽(yáng)性后第7天收集子宮內(nèi)膜，并行腹腔鏡卵巢畸胎瘤剝除術(shù)。

1.3 子宮內(nèi)膜HOXA10-mRNA水平的檢測(cè)

液氮中取出的子宮內(nèi)膜進(jìn)行RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄，采用RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，USA），并且檢測(cè)RNA的完整性及純度。構(gòu)建熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系 25.0μl，含 2×Power SYBR?Green PCR Master Mix 12.5μl、上游引物 F（10 pmol/μl）0.5μl、下游引物 R（10 pmol/μl）0.5μl、cDNA 模板 2.0μl、ddH2O 9.5μl。HOXA10反應(yīng)條件為：95℃ 15 min，95℃10 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃總共延伸10 min。陰性對(duì)照擴(kuò)增體系以三蒸水代替多聚酶，以β-actin基因作為內(nèi)參照，分析各反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，得出反應(yīng)的CT值，并繪制β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出目的基因的相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。目的mRNA=目的基因的拷貝數(shù)/內(nèi)參照的拷貝數(shù)。

1.4 DNA提取與亞硫酸氫鹽修飾

按照說(shuō)明書操作，提取DNA（天根公司，美國(guó)），紫外分光光度計(jì)定量?；蚪MDNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，序列中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，發(fā)生甲基化的胞嘧啶則無(wú)改變。取20.0μl DNA用于亞硫酸氫鹽（天根公司，美國(guó)處理）處理，并置于-80℃保存。

1.5 亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序

亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序（bisulfite sequencing PCR，BSP）引物見(jiàn)附表。由上海生工生物工程設(shè)計(jì)與合成：檢測(cè)HOXA10基因啟動(dòng)子3個(gè)片段中F1的甲基化產(chǎn)物，片段大小均為261 bp，共確定有19個(gè)CpG位點(diǎn)，觀察組共檢測(cè)1 463個(gè)CpG位點(diǎn)。BSP檢測(cè)體系（50.0μl）：Buffer 5.0μl，dNTP 4.0μl，Taq 0.5μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，模板8.0μl，ddH2O 30.5μl，反應(yīng)條件 ：94℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。每個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T-simple載體（參見(jiàn)Takara說(shuō)明書），送北京閱微基因技術(shù)有限公司測(cè)序。

附表 HOXA10-mRNA和亞硫酸氫鹽修飾后HOXA10啟動(dòng)子測(cè)序的引物Attached table HOXA10-mRNA and bisulfite-modified primers for sequencing HOXA10 promoter

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件（SPSS公司，芝加哥，IL，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)資料組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，兩樣本率的比較采用 χ2檢驗(yàn)（n＞40）和 Fisher's確切概率法（n＜40），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

術(shù)后18個(gè)月隨訪均訴綜合治療效果滿意，痛經(jīng)、月經(jīng)過(guò)多明顯改善。對(duì)照組和觀察組術(shù)前子宮內(nèi)膜HOXA10-mRNA分別為（0.9±0.4）和（0.5±0.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.26，P=0.000）。觀察組術(shù)后18個(gè)月子宮內(nèi)膜HOXA10-mRNA為（0.9±0.3），與術(shù)前相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.01，P=0.000）。

對(duì)照組和觀察組患者術(shù)前子宮內(nèi)膜HOXA10啟動(dòng)子F1片段甲基化位點(diǎn)數(shù)分別為（2.2±1.8）和（6.5±3.7）；觀察組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.63，P=0.000）。觀察組術(shù)后18個(gè)月子宮內(nèi)膜HOXA10啟動(dòng)子F1片段甲基化位點(diǎn)數(shù)為（2.8±2.0），與術(shù)前相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.81，P=0.000）。觀察組術(shù)前有34.0%（498/1463）的CpG位點(diǎn)可檢測(cè)到甲基化改變，明顯高于手術(shù)及綜合治療后（9.7%，142/1463），兩組甲基化率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=253.50，P=0.000）。

3 討論

3.1 子宮腺肌病對(duì)生育以及子宮內(nèi)膜容受性的不良影響

子宮腺肌病是雌激素依賴性疾病，有活性的子宮內(nèi)膜侵入肌層后浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，可能與子宮內(nèi)膜-肌層連接帶屏障的破壞有關(guān)，也與免疫因素有關(guān)[8]。子宮腺肌病可以影響精子運(yùn)輸、胚胎植入和宮內(nèi)環(huán)境等多個(gè)環(huán)節(jié)，從而影響生育功能。子宮內(nèi)膜-肌層連接帶是一個(gè)功能單位，與精子運(yùn)輸、胚胎著床、胎盤發(fā)育和月經(jīng)有關(guān)，其破壞可導(dǎo)致腺肌病的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。

TREMELLAN等[11]研究報(bào)道，嚴(yán)重子宮腺肌病內(nèi)膜巨噬細(xì)胞密度明顯高于正常人群，可影響胚胎著床。對(duì)于接受體外受精聯(lián)合胚胎移植術(shù)（in vitro fertilisation，IVF）的婦女，子宮腺肌病患者臨床妊娠率（24/98，24.5%）明顯低于正常婦女（245/567，43.2%）[12]。HOXA10作為子宮內(nèi)膜容受性的經(jīng)典標(biāo)志分子，子宮腺肌病患者分泌期HOXA10基因表達(dá)明顯降低，提示腺肌瘤影響子宮內(nèi)膜容受性[13]。

3.2 子宮腺肌瘤病灶切除聯(lián)合GnRH-a和曼月樂(lè)可改善內(nèi)膜容受性

子宮腺肌瘤切除術(shù)直接去除子宮肌層異位病灶，改善患者臨床癥狀，保留生育功能，減少腺肌病對(duì)盆腔、子宮局部環(huán)境的不良影響，術(shù)后聯(lián)合長(zhǎng)效GnRH-a，可抑制殘余異位病灶生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。長(zhǎng)效GnRH-a治療可抑制腹腔液活化的巨噬細(xì)胞，降低白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，減少炎性因子對(duì)卵子、胚胎的不良影響[14]；還可增加內(nèi)膜細(xì)胞黏附分子如整合素αVβ3的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性[15]。曼月樂(lè)含強(qiáng)效孕激素，高效作用于子宮肌層，并進(jìn)一步使在位內(nèi)膜、肌層異位病灶萎縮，有利于控制腺肌病的發(fā)展。

前瞻性對(duì)照研究[16]報(bào)道，165例子宮腺肌病患者接受保守性手術(shù)聯(lián)合6個(gè)月GnRH-a或單純保守性手術(shù)，術(shù)后隨訪2年妊娠率達(dá)69.0%。本研究顯示，觀察組術(shù)后聯(lián)合GnRH-a和曼月樂(lè)患者HOXA10-mRNA的水平明顯高于術(shù)前。因此，子宮腺肌瘤病灶切除聯(lián)合長(zhǎng)效GnRH-a和曼月樂(lè)，可改善內(nèi)膜容受性。

3.3 子宮腺肌瘤與子宮內(nèi)膜HOXA10啟動(dòng)子甲基化

DNA甲基化是人類基因組最為常見(jiàn)的一種表觀遺傳學(xué)事件，主要發(fā)生在CpG二核苷酸胞嘧啶的5’-碳原子，在腫瘤發(fā)生機(jī)制中有重要意義。一般抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)5’CpG島處于非甲基化狀態(tài)，CpG島高甲基化可以使抑癌基因失活、轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致其表達(dá)下降，最終促使腫瘤的發(fā)生[17]。2005年WU等[6]報(bào)道發(fā)現(xiàn)了HOXA10基因啟動(dòng)子的3個(gè)甲基化區(qū)域，且子宮內(nèi)膜異位癥影響HOXA10基因甲基化，進(jìn)而降低子宮內(nèi)膜HOXA10基因表達(dá)。HOXA10是子宮內(nèi)膜容受性的經(jīng)典標(biāo)志分子，與胚胎著床密切相關(guān)，其基因啟動(dòng)子甲基化水平異常，將影響HOXA10的表達(dá)。本研究顯示，術(shù)后聯(lián)合GnRH-a和曼月樂(lè)治療的患者，HOXA10啟動(dòng)子甲基化率明顯低于術(shù)前，提示方案可有效降低其甲基化水平，進(jìn)而調(diào)控HOXA10的表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜容受性。

本研究著眼于子宮內(nèi)膜容受性的研究，提示子宮腺肌瘤會(huì)對(duì)著床期子宮內(nèi)膜HOXA10產(chǎn)生不利影響，腹腔鏡子宮腺肌瘤切除術(shù)后聯(lián)合GnRH-a和曼月樂(lè)綜合治療，可提高種植窗期子宮內(nèi)膜HOXA10-mRNA水平，改善子宮內(nèi)膜容受性，其機(jī)制可能是通過(guò)降低HOXA10基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。但以上僅是在體實(shí)驗(yàn)研究，GnRH-a和局部高效孕激素對(duì)子宮腺肌病在位內(nèi)膜的微觀改變及作用機(jī)制，仍待體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證及深入探索。