王 珺，彭學勤，龔 芫，申 璇，丁婭妮，茍飛飛，劉祉君，黃 平，李東林

(1.貴州省人民醫(yī)院 婦科，貴州 貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550002)

子宮腺肌病是婦科常見疾病，多發(fā)生于30～50歲，以經量增多、子宮增大伴進行性痛經加重為主要臨床表現，子宮腺肌病雖為良性疾病，卻具有無限生長、浸潤并破壞周圍組織的特性。新生血管形成是異位子宮內膜組織浸潤性生長的關鍵，血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)通過影響子宮肌層毛細血管通透性及新生血管形成，增加子宮內膜細胞的遷移、增殖。有學者觀察到子宮內膜中，腺肌病內膜-肌層界面處VEGF的表達高于遠肌層[1]。研究觀察到抑制VEGF生成后病灶中微血管的生成受阻[2]。也發(fā)現拮抗血管內皮生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)后病灶中微血管形成受到抑制[3]。有研究報道子宮腺肌病異位子宮內膜組織中VEGF和FLK1的表達增強，但未對MVD(Microvessel density, MVD)與VEGF、FLK1的相關性作進一步的深入研究[4]。本研究通過免疫組織化學法觀察子宮腺肌病病灶中及在位子宮內膜中VEGF、VEGFR2和MVD的表達情況，了解子宮腺肌病中MVD與VEGF 、VEGFR2的相關性，為進一步揭示子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集 標本取自2016年9月至2019年5月在貴州省人民醫(yī)院婦科因子宮腺肌病行手術治療的子宮標本，取子宮腺肌病灶及增生期子宮內膜?；颊吣挲g39～47歲，平均年齡(43.12±4.37)歲，近6月內未服用任何藥物，既往月經規(guī)律，未放置宮內節(jié)育器。子宮腺肌病組標本(40例)：取自因子宮腺肌病切除子宮的病灶組織；子宮腺肌病在位內膜標本取自同一患者子宮腺肌病病灶相鄰部位的子宮內膜；對照組標本(30例)：取自行診斷性刮宮術患者的子宮內膜，且經病理證實該子宮內膜無病理性改變者。

1.2 實驗方法 將福爾馬林固定石蠟包埋的組織制備成4 μm切片，枸櫞酸鹽緩沖液中以微波高溫行抗原修復，采用免疫組化技術Envision二步法，使用抗VEGF、VEGFR2和CD34鼠抗人多克隆抗體和Envision試劑盒說明書進行操作。效應產物為棕黃色顆粒被判定為結果陽性，分布于細胞膜和/或胞漿。組織學評分如下[5]：(1)陽性細胞百分率：陽性細胞百分數<5%，記為0分；5%～35%細胞顯色記為1分；36%～65%細胞顯色記為2分；細胞顯色>66%，記為3分。(2)顯色深淺：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。將二者評分相加除以2，作為該切片的最終評分，將0、0.5～1和1.5～3分分別定為陰性(-)、陽性(+)和強陽性(++)。用宮頸癌組織作為陽性對照，每組均用PBS代替一抗作陰性對照。CD34在血管內皮細胞胞漿中被標記為棕黃色顆粒，先在低倍視野下觀察每張切片選擇3個微血管密度大的區(qū)域換高倍鏡(×200)計數，取平均值計作MVD。

2 結果

2.1 子宮腺肌病病灶和腺肌病在位內膜中微血管密度情況 CD34染色觀察到血管上皮細胞膜染色呈棕黃色，MVD在子宮腺肌病組中明顯高于腺肌病在位內膜組和對照組，差異有統計學意義(P<0.0167)。MVD在腺肌病在位內膜組與對照組之間差異無統計學意義(P>0.0167，見表1)。

組別例數MVDFP子宮腺肌病 4082.23±1.315.560.012?腺肌病在位內膜 4063.11±1.215.410.194??對照 3055.42±1.432.350.015???

*：子宮腺肌病組與腺肌病在位內膜組比較；**：腺肌病在位內膜組與對照組比較；***：子宮腺肌病組與對照組比較。

2.2 子宮腺肌病病灶和腺肌病在位內膜中VEGF的表達情況 VEGF蛋白表達于子宮內膜腺體上皮細胞的胞漿中，呈棕黃色。VEGF在子宮腺肌病組、腺肌病在位內膜組和對照組中的陽性表達率為100%，其中++陽性率分別為97.5%、40.0%和30.0%，差異有統計學意義(P<0.05)；VEGF++陽性率在子宮腺肌病組中明顯高于腺肌病在位內膜組和對照組，差異有統計學意義(P<0.0167)，VEGF++陽性率在子宮腺肌病在位內膜組與對照組中表達無統計學差異(P>0.0167，見表2)。

表2子宮腺肌病病灶和腺肌病在位子宮內膜中VEGF的表達情況

組別例數-+++χ2P子宮腺肌病 4001396.6710.013?腺肌病在位內膜 40024162.1340.142??對照3002199.9460.002???

*：子宮腺肌病組與腺肌病在位內膜組比較；**：腺肌病在位內膜組與對照組比較；***：子宮腺肌病組與對照組比較。

2.3 子宮腺肌病組和腺肌病在位內膜組中VEGFR2表達情況 VEGFR2蛋白顯色呈棕黃色，主要位于血管內皮細胞膜及血管壁肌細胞的胞漿中。VEGFR2在子宮腺肌病組、腺肌病在位內膜組和對照組中的陽性表達率分別為100%、87.5%和76.7%，差異有統計學意義(P<0.05)；VEGFR2在腺肌病在位內膜組與對照組之間無明顯差異(P>0.0167)；其中VEGFR2++陽性率分別為95.0%、77.5%和26.7%，差異有統計學意義(P<0.05)。VEGFR2++陽性率在子宮腺肌病病灶中表達明顯高于腺肌病在位內膜組和對照組，差異有統計學意義(P<0.0167，見表3)。

表3子宮腺肌病病灶和腺肌病在位內膜中VEGFR2表達情況

組別例數-+++χ2P子宮腺肌病 4002388.1320.011?腺肌病在位內膜 4054313.3470.115??對照 3071586.1590.016???

*：子宮腺肌病組與腺肌病在位內膜組比較；**：腺肌病在位內膜組與對照組比較；***：子宮腺肌病組與對照組比較。

2.4 子宮腺肌病病灶中MVD與VEGF和VEGFR2相互關系 在子宮腺肌病病灶中，隨著VEGF表達強度的增加，微血管密度明顯增加，Spearman等級相關分析表明，MVD與VEGF表達有顯著相關性(r=0.72,P=0.012)；隨著VEGFR2 表達增加，MVD也隨著增加，MVD與VEGFR2表達有顯著相關性(r=0.63，P=0.016)。

3 討論

子宮腺肌病是婦科常見疾病，子宮腺肌病的發(fā)生和發(fā)展與子宮內異位病灶中微血管形成密切相關，新生血管形成是異位子宮內膜成活生長的關鍵。VEGF通過影響血管內皮細胞的增殖、遷移而誘導新生血管的形成。本研究觀察到VEGF在子宮腺肌病組、腺肌病在位內膜組和對照組各組組織中陽性表達率為100%，但++陽性率在子宮腺肌病組中比較高為97.5%，在對照組中最低為30%。VEGFR2主要存在于微血管內皮胞，在子宮內膜異位病灶中存在VEGFR2受體過表達的狀態(tài)[6]，當子宮腺肌病病灶中子宮內膜腺上皮細胞分泌VEGF進入病灶周圍肌層內與微血管內皮細胞VEGFR2受體結合進而誘導新生血管形成，促進病灶進一步彌漫性侵襲生長。本研究觀察到VEGFR2在子宮腺肌病組、腺肌病在位內膜組和對照組中的陽性表達率分別為100%、87.5%和76.7%，其中++陽性率分別為95.0%、77.5%和26.7%，顯示VEGFR2與子宮腺肌病有關。近來發(fā)現子宮內膜異位癥易感位點在4q12 rs17773813[G]，其編碼產物為VEGFR2上游信號因子，該位點突變與子宮內膜異位癥嚴重程度相關，揭示VEGF-VEGFR2通路在子宮內膜異位癥發(fā)病機制中的重要作用[7]。在分析MVD與VEGF、VEGFR2的相互關系時發(fā)現，子宮腺肌病病灶中MVD明顯高于腺肌病在位內膜和對照組子宮內膜中微血管密度，在子宮腺肌病病灶中隨著VEGF表達強度的增加MVD明顯增加，隨著VEGFR2 表達增加MVD也隨著增加，MVD與VEGF、VEGFR2表達呈正相關性。子宮腺肌病病灶中異位子宮內膜腺上皮細胞VEGF表達顯著增強，對子宮組織中微血管生成活性增加，與子宮腺肌病病灶的進展密切相關，提示微血管形成在子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抗血管生成可能是控制病灶生長和延緩病情進展的重要方向。