劉嫚嫚 都鵬飛

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科，合肥 230000)

病毒性心肌炎是常見的兒童心血管疾病，可由多種病毒誘導，以柯薩奇B組3型病毒(coxsackievirusB3,COXB3)最為常見。研究表明，在病毒性心肌炎早期，心肌損傷的主要原因來自病毒對心肌的直接損傷，急性期之后則是以病毒介導的免疫損傷為主[1]，研究表明，其發(fā)病過程與宿主的自身遺傳背景因素相關(guān)，不同個體對于病毒的易感性不同[2]，感染后也會出現(xiàn)不同結(jié)果，本研究首先建立病毒性心肌炎體外模型，在此基礎(chǔ)上通過檢測小鼠心肌組織中MHC基因的表達并以IFN-γ作為參照物，來探究對感染柯薩奇病毒的小鼠心肌細胞的MHC基因多態(tài)性的易感及保護作用，以闡明對MHC基因多態(tài)性對于病毒性心肌炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：SPF級4周齡雄性Balb/C小鼠，購買于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心；

病毒：COXB3 Nancy株由安徽醫(yī)科大學教研實驗室贈予，使用前進行病毒滴定半數(shù)致死量；

主要材料與試劑：人宮頸癌細胞(Hela細胞)購買于南京凱基生物公司；Trizol提取液、多聚甲醛、0.25%胰酶、 DL2000marker、氯、TaKaRa One-Step RNA PCR Kit(AMV)、ELISA試劑盒、RT試劑、熒光定量PCR試劑Sybr green I、蘇木素-伊紅染色、中性樹脂等；

1.2 方法

1.2.1細胞實驗部分：將Hella細胞進行培養(yǎng)、傳代處理，C0XB3病毒進行接種及毒力擴增，收集病毒上清液，進行毒力滴定并計算TCID50；

1.2.2動物實驗確定病毒感染量：選取實驗小鼠40只并隨機分為A、B、C、D 4組，選取D組作為對照組，予以TCID50病毒濃度接種A組、10-1TCID50濃度接種B組、10-2TCID50濃度接種C組，3種濃度病毒毒力的病毒液0.1 mL/只，觀察4組小鼠的活動狀況、精神狀態(tài)及體質(zhì)量變化等，于第7天處死小鼠，記錄血清CKMB水平及心肌組織病理改變，選擇合適的造模病毒感染量；

1.2.3觀察血清IFN-γ水平：選取120只小鼠，隨機均勻分為病毒組及對照組，根據(jù)上述實驗確定的病毒感染量進行腹腔接種病毒，建立宏觀體征表，同時每天隨機從2組中各選取兩只小鼠進行取血解剖，ELISA法檢測血清IFN-γ濃度，按照對照組結(jié)果，記錄IFN-γ的水平變化；

1.2.4檢測基因表達：選取病毒組及對照組小鼠各40只，分別于實驗第3、7、14及28天分別處死兩組小鼠各8只進行解剖處理，ELISA法檢測血清IFN-γ濃度，心肌組織HE染色觀察，計算心肌病變積分；

1.2.5等位基因表達水平檢測：根據(jù)文獻報道的Balb/c小鼠H2-Eb區(qū)第二個外顯子的核酸序列設(shè)計4組序列特異性引物(分別稱為MudoEb1、MudoEb4、MudoEb5、MudoEb7)，以IFN-γ基因作為內(nèi)參照，RT-PCR法檢測心肌組織上述基因表達情況，引物序列見下表：

表1 PCR 擴增采用的引物Table 1 Primers used in PCR amplification

1.2.6感染病毒的檢測及鑒別：對心肌組織進行病毒分離與RNA提取并以實時熒光定量PCR法(real-time fluorescent quantitative PCR，Q-PCR)進行病毒鑒定:先用隨機引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后設(shè)計特異性的引物和sybr green I熒光染料進行熒光定量PCR檢測。SYBR Green I 是一種能與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料，其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，熒光信號不斷積累，根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。

病毒引物設(shè)計：B3F 5′GGA CCT GCT CAA ATC GGT AGA C 3′

B3R 5′CAA ATG TGG TCA ATG CCT GTA AG 3′

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)分析，VMC組小鼠與對照組小鼠的心肌組織病理積分用two-way ANOVA檢驗法進行比較，基因頻率=陽性基因數(shù)/(樣本數(shù)×2)，等位基因的基因頻率比較采用卡方檢驗，將含有易感基因及不含VMC有此基因的VMC組進行比較，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒TCID50計算

購買的Hela細胞排列緊密整齊，形態(tài)規(guī)則，包膜完整，折光度均勻，經(jīng)COXB3 Nancy株感染后72 h后細胞明顯皺縮變形，包膜破裂，排列紊亂，培養(yǎng)液中可見較多細胞碎片漂浮，通過觀察細胞CPE，運用Reed-Muench法計算TCID50為10-3。

2.2 造模病毒濃度合適量

圖1 第7天4組小鼠心肌組織病理圖片F(xiàn)ig.1 The 7th day pathological image in four groups

A組小鼠第2～3天開始出現(xiàn)活動量及體質(zhì)量下降，進食水減少，反應(yīng)遲鈍，第4天出現(xiàn)后肢癱瘓并開始死亡，至第7天出現(xiàn)死亡高峰，血清CKMB為(4022.39±260.56)U/L，高倍鏡下顯示心肌間質(zhì)水腫，心肌纖維萎縮斷裂，單核細胞及淋巴細胞大量浸潤。B組及C組小鼠第4天開始出現(xiàn)體質(zhì)量及活動量下降，第6天開始體質(zhì)量回升，無小鼠死亡，第7天小鼠血清CKMB水平：A組(1085.78±237.3)U/L、C組(909.34±187.25)U/L，心肌病理顯示心肌細胞排列整齊，可見少量的炎性細胞浸潤，對照組D組小鼠狀態(tài)良好，飲食活動量無減少，體質(zhì)量逐漸增加，無死亡病例，第7天血清CKMB為(779.47±38)U/L，病理示心肌細胞排列整齊，間質(zhì)內(nèi)未見明顯炎癥細胞浸潤表現(xiàn)。結(jié)合小鼠體質(zhì)量變化、血清CKMB水平及心肌病理改變選擇的造模合適病毒量為103TCID50/mL的COXB3液0.1 mL/只。

2.3 血清IFN-γ水平變化

取血清后進行IFN-γ水平的ELISA檢測，以標準物的濃度為橫坐標，用酶標儀在450 nm下的波長下測定吸光度(A值)為縱坐標，測繪出標準曲線，計算出標準曲線的直線回歸方程式為y=0.002x+0.0034,計算樣本實際濃度，并繪制血清IFN-γ水平變化圖：及樣本的實際濃度，并繪制折線圖如下：

以上結(jié)果顯示小鼠血清IFN-γ水平在接種病毒第3天開始升高，2周達高峰，3周開始慢慢降低。

圖2 血清IFN-γ水平的變化趨勢Fig.2 The changing trend of IFN-γ level

2.4 兩組小鼠心肌組織病理積分

經(jīng)統(tǒng)計學分析，病毒組小鼠與對照組小鼠心肌組織病理積分結(jié)果見表2、圖3。

表2 VMC實驗組與對照組小鼠的病理積分比較Table 2 The pathological intergral comparison between VMC mice model and normal control group

圖3 病毒組小鼠心肌組織病理積分變化趨勢注：1、2、3、4代表第3、7、14、28天小鼠心肌組織病理積分平均值Fig.3 The changing trend of pathological integral in VMC mice model groupNote：The number 1、2、3、4 represent pathological integral of the mice that anatomized at 3rd/7th 14th/28th day

2.5 基因表達測序結(jié)果

結(jié)合已研究過的有功能的多態(tài)性位點及NCBI數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)既往文獻報道的Balb/c小鼠H2-Eb區(qū)第二個外顯子核酸序列設(shè)計5組序列特異性引物(分別稱為MudoEb1、MudoEb4、MudoEb5、MudoEb7)以及IFN-γ基因表達作為內(nèi)參照，RT-PCR技術(shù)檢測上述基因表達水平，在32只病毒組小鼠中，MudoEb 5檢測陽性的共有24只(基因頻率37.5%)，MudoEb 7檢測陽性的有9只(基因頻率14.1%)，對照組中檢測出MudoEb5 陽性的有6只(基因頻率9.4%)，MudoEb7陽性共2只(基因頻率3.1%)，兩種等位基因的表達與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(MudoEb 5λ2=20.33P=0.00OR=13,MudoEb 7，λ2=5.38P=0.02OR=5.7)未測出其余2組等位基因陽性結(jié)果，同時與相應(yīng)日齡的病理積分進行相關(guān)性分析，經(jīng)計算第3天的病理積分與MudoEb5陽性的結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.449P<0.05，第7天，r=0.745P<0.05，第14天 r=0.712P<0.05，第14天 r=0.676P<0.05，表明VMC小鼠病理積分與MudoEb 5表達水平之間存在正相關(guān)關(guān)系，同時進行MudoEb 7表達水平與病理積分的相關(guān)性分析表明，兩者也存在正相關(guān)。

圖4 第3天A組病毒組小鼠MudoEb 5基因序列電泳結(jié)果注：MudoEb 5 PCR產(chǎn)物大小為109 bp，A組小鼠中有6只MudoEb 5基因檢測陽性，其中A1、A2、A3、A5、A6、A8為陽性；A4、A7為陰性；M: DNA Marker DL2 000Fig.4 MudoEb 5 PCR expression in VMC model mice group in 3rd dayNote：PCR result of MudoEb 5 base number is 109 bp，6 mice MudoEb 5 gene is positive，Among group A,mice; A1、A2、A3、A5、A6 and A8 MudoEb5 gene is posiive；A4 and A7 are negative；M:DNA Marker DL2 000

圖5 第3天A組病毒組小鼠MudoEb 7 基因序列電泳結(jié)果注：MudoEb 7 PCR產(chǎn)物大小為103 bp， A組小鼠中2只MudoEb 7基因檢測陽性，其中A6、A8為陽性；余為陰性；M: DNA Marker DL 2000Fig.5 MudoEb 7 PCR expression in VMC model mice group in 3rd dayNote：PCR result of MudoEb 7 base number is 103 bp,2 mice MudoEb 7 gene is positive， Among group A,A6 and A8 MudoEb 7 gene is positive；others are negative；M: DNA Marker DL2 000

2.6 實驗小鼠感染病毒檢測

Q-PCR定量檢測感染心肌小鼠病毒與設(shè)計的COXB3引物序列進行比對，表明實驗組小鼠確實為COXB3嗜心型病毒引起，結(jié)果如圖6、圖7。

圖6 COXB3的Q-PCR定量情況Fig.6 Quantitative situation of Q-PCR in COXB3

圖7 內(nèi)參引物序列的Q-PCR定量結(jié)果Fig.7 Q-PCR quantitative results of internal ginseng primer sequences

3 討論

病毒性心肌炎是指由嗜心肌病毒感染引起心肌及其間質(zhì)的炎性損傷，可導致心功能障礙和(或)心律失常，甚至猝死，多發(fā)于兒童。發(fā)病輕重程度不一，缺乏特異性診療方法，對患者的健康及生活質(zhì)量影響較大。國內(nèi)外學者通過血清學檢測、原位雜交、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)等分子生物學技術(shù)，證實可引起心肌炎的病毒常見有30余種[3]，包括柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、?？刹《尽⑾俨《?、流感及副流感病毒等，以柯薩奇病毒最為常見，文獻報道，VMC致死患者心內(nèi)膜活檢中，50%可檢測出COXB3感染[4]。目前普遍認為VMC的發(fā)病機制主要包括：病毒的直接損傷；病毒介導的免疫損傷及多種致炎因子和NO等介導的心肌損害和微血管損傷[5]。其中以機體炎癥反應(yīng)最為主要,病毒入侵機體后心肌肌球蛋白等抗原暴露，此抗原與病毒表面抗原之間存在交叉作用，可直接作用于機體免疫細胞或間接通過信號轉(zhuǎn)導分子促進病毒傳播和激發(fā)T細胞，伴隨著炎癥細胞的浸潤和炎癥因子(TNF-α、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ 等)表達量升高[6]; 心肌組織的持續(xù)炎癥反應(yīng)導致了心肌組織損傷和心肌細胞的凋亡壞死, 部分患者最終可演變?yōu)閿U張性心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)和慢性心臟損傷, 在人類中有很高的發(fā)病率和致死率[7]。

機體感染嗜心肌型病毒后需依賴T細胞對病毒抗原進行識別和清除，抗原的加工提呈過程又影響T細胞對抗原的識別，進而影響疾病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，此外不同人群對于同一株病毒的易感性不同可引起不同的慢性化或自限性清除，而免疫反應(yīng)的強弱與宿主的人類白細胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)有關(guān)，HLA受控于MHC基因簇，位于人類第6號染色體短臂(6p21.31-6p21.32)，HLA基因編碼表達的產(chǎn)物在免疫系統(tǒng)中主要負責細胞間相互識別以及誘導免疫反應(yīng)，具有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)功能[8]。MHC基因包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3類基因。Ⅰ類基因包括A、B、C、E、F、G等基因座,編碼組織相容性抗原的基因,編碼產(chǎn)物存在于所有有核細胞表面;Ⅱ類基因含有DP、DQ、DR、DM、DO、DN 6個亞區(qū),編碼調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖和相互作用及控制機體免疫反應(yīng)強度的基因;Ⅲ類基因位于Ⅰ、Ⅱ類基因之間,編碼控制某些補體成分和其受體產(chǎn)生的基因[9]。三者在常染色體上緊密連鎖形成單倍型,表現(xiàn)共顯性遺傳,又有超基因(supergene)之稱[10]。每類基因都有很多基因位點,而每個基因位點存在著大量的等位基因,使得MHC基因成為迄今所發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)最為復雜的遺傳多樣性系統(tǒng)，這些等位基因出現(xiàn)的頻率具有顯著的人種和地區(qū)差異。MHC的多樣性由堿基的變化所形成[11]。堿基變化是人體適應(yīng)外環(huán)境的調(diào)節(jié)方式，堿基變化導致氨基酸的變化，因此堿基突變?nèi)绻l(fā)生在抗原肽結(jié)合區(qū)有可能對功能和抗原有所影響。在體液免疫反應(yīng)中，有3方面的因素影響著病毒抗原遞呈及抗原肽與MHC分子、TCR三元復合物之間的相互作用，包括抗原肽側(cè)鏈和TCR之間的相互作用、肽骨架和MHC II類分子之間形成的序列非依賴性的氫鍵、抗原肽側(cè)鏈和MHC II類分子抗原結(jié)合槽(antigen binding cleft)之間的相互作用[12]。根據(jù)已研究MHC的晶體結(jié)構(gòu)：II類α鏈和β鏈的遠膜區(qū)的抗原結(jié)合槽中分布與疾病密切相關(guān)的氨基酸序列，其由MHC 等位基因編碼[13]。因此，MHC II等位基因多態(tài)性可引起抗原結(jié)合槽的構(gòu)象、結(jié)合及遞呈抗原肽的效率不同，從而引起不同的MHC II類等位基因?qū)膊〉囊赘行圆煌?。Balb/c小鼠的主要組織相容性復合體位于17號染色體，又稱為H-2復合體(Histoeompatibility 2 eomplex,H-2 eomplex),與小鼠的特異性體液免疫應(yīng)答相關(guān)的基因簇位于其I區(qū)內(nèi)的E亞區(qū)，而E亞區(qū)的多態(tài)性又絕大部分體現(xiàn)在其β座位(H2一Eb)的第二個外顯子上[14]，既往研究表明，經(jīng)過調(diào)控MHC II上的免疫原件可以改變VMC小鼠模型的癥狀表現(xiàn)及預后[15]，本實驗通過利用小鼠H2-Eb基因位點多態(tài)性，采用PCR-SSP基因技術(shù)檢測出H2-Eb位點上等位基因在小鼠機體感染同一COXB3病毒株之后的表達水平不同，結(jié)果顯示：MudoEb5、MudoEb7基因型與COXB3的感染轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，同時VMC小鼠炎癥水平與兩種等位基因型的表達水平之間存在正相關(guān)性，MudoEb5基因型的VMC小鼠炎癥反應(yīng)更強烈，但由于缺乏H2-Eb在COXB3感染中確切作用機制，未來需要進一步探索H2-Eb等位基因，甚至HLA等位基因及其SNPs的分子生物學功能。

本研究存在著一些局限性，首先缺少明確的作用機制研究結(jié)論，其次實驗研究對象為小鼠，關(guān)于人類的病毒性心肌炎與HLA基因多態(tài)性的關(guān)系尚待研究。但本實驗結(jié)果證實了H2-Eb基因多態(tài)性與病毒感染小鼠的相互關(guān)系，使之成為病毒性心肌炎發(fā)病機制的可能解釋，但關(guān)于HLA基因多態(tài)性與VMC關(guān)系仍需大樣本、不同民族、前瞻性及相關(guān)功能性研究中得到進一步驗證，同時本實驗為開展與機體免疫反應(yīng)相關(guān)疾病的發(fā)病機制等研究提供新思路和方向。

綜上所述，H2-Eb基因多態(tài)性可顯著影響小鼠機體對于COXB3的易感性以及感染后的免疫反應(yīng)水平，但仍需要大樣本的實驗研究和嚴格設(shè)計的生物學研究進一步證實。