陳亞坤 孫 婧 蔣亞君 王昕昉 劉曉宇 戴連攀 盧選成 李曉燕

(1. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，北京 102206)(2. 中科院北京生命科學(xué)研究院，北京 100101)

干擾素(Interferon，IFN)是能夠干擾病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖的一種蛋白，1957年由Isaacs與Lindenmann共同發(fā)現(xiàn)。干擾素分為I型干擾素和Ⅱ型干擾素兩大類[1]。I型干擾素包括IFN-α和IFN-β，Ⅱ型干擾素也稱為IFN-γ[2]。干擾素生物效應(yīng)發(fā)揮的前提是，必須要與細(xì)胞表面相應(yīng)的信號(hào)受體結(jié)合[2-3], 如果干擾素受體缺乏，會(huì)導(dǎo)致干擾素?zé)o法與之結(jié)合，進(jìn)而無(wú)法發(fā)揮干擾素的生物學(xué)效應(yīng)。干擾素受體(IFNR)分為I型干擾素受體(結(jié)合I型干擾素)和Ⅱ型干擾素受體(結(jié)合Ⅱ型干擾素)，干擾素受體基因敲除小鼠屬于免疫缺陷動(dòng)物模型，是多種病毒研究的敏感動(dòng)物模型，可用于病毒的致病機(jī)制研究以及抗病毒疫苗、藥物研發(fā)。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心通過(guò)引進(jìn)I型干擾素受體(Ifnar)基因敲除小鼠，并在負(fù)壓屏障設(shè)施內(nèi)以1雄2雌的合籠方式進(jìn)行了飼養(yǎng)、保種繁育，并對(duì)繁育的仔鼠基因型進(jìn)行了鑒定，結(jié)果獲得了穩(wěn)定的ifnar-/-基因型小鼠。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Ifnar基因敲除小鼠純合子自重慶醫(yī)科大學(xué)引進(jìn)，品系名：B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax， 遺傳背景：C57BL/6，基因型：ifnar-/-。

1.2 儀器和試劑

PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司，型號(hào)：TC-XP-D)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司，型號(hào)：K8360)，核酸水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司， 型號(hào)：DYCP-31DN)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(艾本德中國(guó)，MiniSpin)，恒溫水浴鍋(上海習(xí)仁，型號(hào)：HH-12)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水機(jī)(北京木牛流馬精華工程技術(shù)有限公司， MN-LM200 J)；動(dòng)物飲水專用滅菌器(凌云博際北京科技有限公司，Ⅲ型)。

基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司， 貨號(hào)：EE101)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司， 貨號(hào)： AS111)，2 K DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：BM101)， Biotium Gelred核酸染料(10000×)(萊博斯特(北京)科技有限公司，貨號(hào)：41003)。

1.3 Ifnar基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁育

Ifnar基因敲除小鼠飼養(yǎng)在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心負(fù)壓屏障設(shè)施內(nèi)[4], 在獨(dú)立通風(fēng)籠盒(individually ventilated cages，IVC)內(nèi)飼養(yǎng)和繁殖，飼養(yǎng)溫度控制在20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲食進(jìn)水，晝夜光照節(jié)律。按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，墊料、鼠盒均經(jīng)過(guò)131 ℃、15 min 高壓蒸汽滅菌后使用。飼料采用華阜康公司生產(chǎn)的SPF級(jí)小鼠飼料,小鼠飲水采用超濾凈化水機(jī)生產(chǎn)后再高壓滅菌處理。墊料每周更換1次,每日補(bǔ)充充足飼料及飲水。采用1雄2雌合籠方式進(jìn)行繁殖。

對(duì)14籠合籠的純合Ifnar基因敲除小鼠(5～10個(gè)月月齡)的生產(chǎn)情況進(jìn)行4個(gè)月的跟蹤，對(duì)生產(chǎn)的仔鼠數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

1.4 小鼠的基因型鑒定

1.4.1鼠尾基因組DNA提取:剪取小鼠尾尖長(zhǎng)0.2～0.3 cm的組織，放入容量1.5 mL離心管中，快速放入-20 ℃保存。用DNA提取試劑盒提取小鼠基因組DNA后，放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2PCR擴(kuò)增反應(yīng):鑒定引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成， Common：CGAGGCGAAGTGGTTAAAAG, Wild type Reverse：ACGGATCAACCTCATTCCAC, Mutant Reverse：AATTCGCCAATGACAAGACG。以上3種引物按照1∶1∶1比例混合至10 μmol/L，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，引物混合物 1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌ddH2O 7 μL。采用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行Touchdown循環(huán)擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 2min；變性94 ℃ 20 s，復(fù)性65 ℃ 15 s，復(fù)性溫度每個(gè)循環(huán)下降0.5 ℃，延伸68 ℃ 10 s，循環(huán)10次；變性94 ℃ 15 s；復(fù)性60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 10 s，循環(huán)28次；最后延伸72 ℃ 2 min；10 ℃停留。最后樣品取出,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3瓊脂糖凝膠電泳:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL，在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析，以120v由負(fù)極向正極電泳30 min，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中拍照觀察。

1.4.4基因型結(jié)果判定:按條帶不同鑒別出各個(gè)基因型小鼠。鼠尾基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳基因型片段為:Common和 mutant reverse 引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為250 bp左右，為突變型(KO)小鼠；Common和 Wild type reverse引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為155 bp左右,為野生型(WT)小鼠；250 bp和155 bp兩條電泳條帶均存在的為雜合(HET)小鼠。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠外形特征

C57BL/6(=B6)遺傳背景的Ifnar基因敲除小鼠成年鼠的被毛為黑色，與野生型B6小鼠相同。Infar基因敲除小鼠交配后產(chǎn)生的子代新生幼鼠, 兩眼緊閉，四肢蜷縮，皮膚無(wú)毛，呈肉紅色,與野生型幼鼠外觀形態(tài)上無(wú)明顯差異。

圖1 基因敲除小鼠的成年鼠和仔鼠外形特征注：A.成年小鼠 B.1日齡仔鼠Fig.1 Appearance of adult and neonatal knockout miceNote：A. adult mouse B. neonatal mice

2.2 小鼠的繁育情況

Ifnar基因敲除母鼠妊娠期為20 d左右，哺乳期為21 d左右，小鼠的性成熟期為45～60 d，以上小鼠生理特性和野生型無(wú)明顯差異。但在產(chǎn)仔數(shù)量上，大多在每胎10只以下，較野生型每胎8～15只低。對(duì)14籠5～10個(gè)月月齡小鼠的生產(chǎn)情況進(jìn)行4個(gè)月的跟蹤，對(duì)生產(chǎn)的仔鼠數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。在4個(gè)月期間14籠小鼠共計(jì)生產(chǎn)41胎， 產(chǎn)仔數(shù)量總數(shù)為225只，平均每胎為(5.6±2.7)只，和野生型理論值每胎8～15只相比較，差異極顯著(P﹤0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 小鼠基因型鑒定結(jié)果

部分小鼠鼠尾基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果如下圖：N為陰性水對(duì)照，未見(jiàn)條帶。1號(hào)樣品條帶在155 bp位置左右，為野生型，2～8號(hào)樣品條帶在250 bp位置左右，為I型干擾素受體(ifnar)基因敲除小鼠。

圖2 部分小鼠PCR基因型鑒定結(jié)果注：M:Marker(2 kb DNA marker)1：野生型樣品 2～8：不同樣品 N:陰性對(duì)照Fig.2 Results of genotype identification of some mice by PCRNote: M:Marker(2 kb DNA marker)1:wild type 2～8: Different samples N: Negative control

3 討論

在敲除小鼠的飼養(yǎng)過(guò)程中，其外觀形態(tài)、性成熟時(shí)間、妊娠時(shí)間，哺乳時(shí)間等，與野生型小鼠相比未見(jiàn)明顯差異。但在產(chǎn)仔數(shù)量上，敲除小鼠(5.6±2.7)只明顯較野生型每胎產(chǎn)仔數(shù)量少，和理論值每胎8～15個(gè)存在極顯著差異。當(dāng)然,不排除飼養(yǎng)條件,環(huán)境因素等對(duì)小鼠的生殖能力造成影響,但經(jīng)觀察,同等條件下本中心其他小鼠具有和理論值相當(dāng)?shù)纳衬芰?。并且本研究中產(chǎn)仔數(shù)量的差異與王曉東等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，他們對(duì)三種品系的基因敲除小鼠產(chǎn)仔數(shù)量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，三種基因敲除小鼠平均每胎產(chǎn)仔數(shù)量與其背景小鼠相比均低，其中II型干擾素受體基因敲除小鼠平均每胎產(chǎn)仔數(shù)為(5.25±0.82)只。因此綜合以上結(jié)果推測(cè)，某些基因的敲除可能會(huì)影響敲除小鼠的繁殖能力。本研究中Ifnar敲除小鼠產(chǎn)仔能力較低，可能是由于I型干擾素受體基因的敲除影響了某些基因的調(diào)控表達(dá)，使敲除小鼠的某些功能喪失，造成生殖功能障礙。但這種差異是否確實(shí)與基因敲除有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。

基因敲除小鼠繁育保種的一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是基因型鑒定，方法主要包括PCR法和傳統(tǒng)的Southern bolt法[7]。本研究采用試劑盒提取鼠尾組織基因組DNA，參照J(rèn)ackson Laboratory提供的引物序列，通過(guò)普通PCR擴(kuò)增,凝膠電泳成功鑒定出Ifnar敲除鼠的基因型，與southern bolt鑒定法相比較，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)較短、費(fèi)用較低，該方法可以作為Ifnar基因敲除小鼠基因型檢測(cè)的一種快速可靠方法。

1994年Müller 等首次成功制成Ifnar敲除小鼠[8],屬于基因修飾的免疫缺陷小鼠模型。小鼠由于性格溫順易飼養(yǎng)，便于操作，繁殖能力強(qiáng)，且對(duì)病毒易感等特性，廣泛應(yīng)用于各種病毒致病機(jī)理以及疫苗和藥物評(píng)價(jià)的研究。但是免疫功能健全的小鼠對(duì)有些病毒耐受,不能建立病毒感染模型或模型不利于后續(xù)病毒各項(xiàng)研究,免疫缺陷小鼠模型的建立就顯得尤為重要。例如，用寨卡病毒感染免疫功能健全的C57B/6,BALB/C,CD1小鼠，組織中未檢測(cè)到病毒RNA，小鼠也未出現(xiàn)疾病癥狀[9-11]。但Lazear等[12]用寨卡病毒接種Ifnar敲除小鼠，小鼠則高度易感，呈現(xiàn)后肢無(wú)力、癱瘓等典型的神經(jīng)癥狀。因此，ifnar-/-免疫缺陷小鼠模型的建立和應(yīng)用對(duì)某些特定病毒的研究至關(guān)重要。

目前，Ifnar敲除小鼠在人腸道病毒71 型(Enterovirus 71,EV71)[13-14]、登革熱病毒(Dengue virus，DENV)[15]和寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)[16]等的研究中都有應(yīng)用。近年來(lái)，隨著zika病毒研究成為熱點(diǎn)問(wèn)題，對(duì)于干擾素受體敲除小鼠的應(yīng)用也隨之日益增加。但這些前期的研究中應(yīng)用的干擾素受體敲除小鼠多為129背景,如 I型干擾素受體基因敲除的A129，II型干擾素受體基因敲除小鼠的G129，以及以上兩種鼠雜交得到的AG129。基因敲除小鼠常見(jiàn)于129小鼠是因?yàn)槠銭S做打靶時(shí)，中靶效率高，囊胚注射后成功率也高。最初Zika病毒研究中，小鼠模型也多為129背景,但近來(lái)B6背景的Ifnar敲除小鼠模型也多有建立[12，17]。因?yàn)锽6小鼠遺傳背景和生理生化指標(biāo)更清楚，當(dāng)只有129背景品系小鼠時(shí)，可把129小鼠和B6小鼠回交，獲得B6類似背景的小鼠，再進(jìn)行試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中小鼠為129小鼠和B6小鼠回交后得到的B6背景Ifnar敲除小鼠。

為滿足科學(xué)試驗(yàn)研究的需要，本中心引進(jìn)B6背景的ifnar基因敲除小鼠，在負(fù)壓屏障動(dòng)物房飼養(yǎng),通過(guò)一段時(shí)間的繁殖、鑒定，已獲得一定數(shù)量的ifnar基因敲除小鼠，這為多種病毒的深入研究提供了一定的前期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)，并且相較于129品系的小鼠模型，遺傳背景更清晰，生理生化指標(biāo)更清楚，有助于得到重復(fù)性更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。