楊永立 李 鋒 汪云龍 劉發(fā)琴 周國春 高仕平 徐子辰 徐永德

(昆明科靈生物科技有限公司，昆明 650550)

隨著人們生活水平的提高，高血脂癥(Hyperlipidaemia)和脂肪肝(fatty liver)的發(fā)病率在逐年增加。高血脂癥，又稱脂代謝紊亂，即血清總膽固醇(Total Cholesterol, TC)，甘油三酯(Triglyceride, TG)，低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL)的增高以及高密度脂蛋白(high-density lipoprotein HDL)的降低，這不僅是脂代謝紊亂的標(biāo)志，也是動(dòng)脈粥樣硬化，冠心病、腦卒中、高血壓、心臟病，中風(fēng)和脂肪肝等疾病的主要危險(xiǎn)因素[1-4]。高脂血癥已成為醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)，理想的高脂血癥動(dòng)物模型不僅是研究人類高脂血癥發(fā)病機(jī)理的有效工具，也是開展脂代謝異常及動(dòng)脈粥樣硬化研究的重要手段。

建立高脂血癥模型的動(dòng)物，要考慮造模動(dòng)物對(duì)膳食脂質(zhì)調(diào)節(jié)和代謝、生理功能反應(yīng)以及高脂血癥的各種癥狀等要與人類盡可能相似。非人靈長類動(dòng)物因在遺傳、生理以及生物學(xué)特性方面與人類十分相似，高脂血癥動(dòng)物所表現(xiàn)的病理特征和血脂變化規(guī)律與人類高血脂患者的臨床特征也十分相似[5]，故選用食蟹猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用高脂膳食飼料誘導(dǎo)方法，初步建立高脂血癥食蟹猴動(dòng)物模型，本研究通過檢測TC、HDL、LDL、TG的水平來衡量血脂變化情況，同時(shí)對(duì)其血脂指標(biāo)變化趨勢進(jìn)行分析，為篩選理想的高脂血癥模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 正常飼養(yǎng)的健康成年雄性食蟹猴804只，由昆明亞靈生物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(滇)K2015-0003；實(shí)驗(yàn)過程在生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型國家地方聯(lián)合工程研究中心昆明科靈生物科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(滇)K2012-0002。

1.1.2實(shí)驗(yàn)飼料:正常飼料由昆明亞靈生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滇)K2018-0004。高脂飼料由廣州市國龍科技有限公司提供，(加工配方：15%豬油、30%糖、0.5%膽固醇、5%無營養(yǎng)物質(zhì)、49.5%基礎(chǔ)飼料)，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2014-0026。

1.1.3主要試劑及儀器設(shè)備:膽固醇，高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三脂檢測試劑盒由羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供。使用羅氏全自動(dòng)生化分析儀(c501)檢測血清樣品。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及高脂血癥動(dòng)物模型的制備:隨機(jī)挑選435只食蟹猴為模型組，飼喂高脂膳食飼料；369只為對(duì)照組，飼喂正常飼料。模型組和對(duì)照組動(dòng)物每天每只飼喂200 g飼料，分別在上午08：00和下午16：00各給予100 g。每日中午13：30飼喂150 g水果，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，本試驗(yàn)分別在第4個(gè)月、第8個(gè)月、第12個(gè)月、第18個(gè)月采血進(jìn)行血脂檢測。

1.2.2血液樣品采集及血脂檢測:動(dòng)物空腹12～14 h，前肢靜脈采血3 mL，3 000 r/min 離心10 min后收集血清。馬上使用羅氏全自動(dòng)生化分析儀(c501)檢測TC,HDL,LDL和TG。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 高脂膳食誘導(dǎo)組造模前、后血脂指標(biāo)檢測結(jié)果比較

高脂膳食誘導(dǎo)組血脂指標(biāo)與造模前自身對(duì)照，TC、HDL、LDL在飼喂高脂膳食飼料4個(gè)月后明顯升高，在4～12個(gè)月均維持在較高水平，18個(gè)月略下降，但與實(shí)驗(yàn)前相比均極顯著上升(P<0.01); TG在飼喂高脂膳食飼料8個(gè)月后明顯升高，并維持在較高水平，與實(shí)驗(yàn)前相比差異極顯著(P<0.01)。

2.2 高脂膳食誘導(dǎo)組與正常飼料對(duì)照組血脂指標(biāo)檢測結(jié)果比較

造模后，高脂膳食誘導(dǎo)組與正常飼料對(duì)照組比較，TC、HDL、LDL、TG均高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。

2.3 對(duì)照組、模型組實(shí)驗(yàn)前后血脂指標(biāo)檢測結(jié)果比較

血脂各項(xiàng)指標(biāo)的分析結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組血清TC、HDL、LDL、TG均無明顯的變化。模型組TC水平有遞增趨勢，在飼喂高脂膳食飼料4個(gè)月后，與實(shí)驗(yàn)前相比呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01),并且TC明顯高于食蟹猴血脂的正常參考水平，具備了高膽固醇血癥特征；HDL先增加后降低，但與實(shí)驗(yàn)前相比均極顯著上升(P<0.01)；LDL在飼喂高脂膳食飼料4個(gè)月后水平快速遞增，雖然后期有下降，但都維持在較高水平，并且與實(shí)驗(yàn)前相比極顯著上升(P<0.01)，且明顯高于食蟹猴血脂的正常參考水平，提示脂代謝紊亂導(dǎo)致了高脂血癥；TG水平呈現(xiàn)遞增趨勢，在8個(gè)月時(shí)極顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 食蟹猴高脂血癥模型組與對(duì)照組血脂指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果Table 1 Indexes about lipids of the model group and the control

注：TC, HDL, LDL, TG 單位均為mmol/L。同列字母相同表示差異不顯著(P>0.05),字母不同表示差異極顯著(P<0.01)

Note：The units of TC, HDL, LDL and TG are all mmol/L, The same letter in the same trade means no significant difference(P>0.05),while different letter means significant difference or extremely significant(P<0.05,P<0.01)

2.4 高脂膳食誘導(dǎo)組血脂檢測指標(biāo)TG水平

飼喂高脂膳食飼料動(dòng)物的TG水平，個(gè)體間存在較大差異。TG代謝極端異常的動(dòng)物TG水平可突然升高至57.6 mmol/L, 而飼喂相同時(shí)間高脂膳食飼料的動(dòng)物TG水平最低的為 0.1 mmol/L。

3 討論

非人靈長類動(dòng)物是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在遺傳學(xué)、解剖學(xué)和生理學(xué)上都與人類高度相似。食蟹猴體型小，性情溫順，便于實(shí)驗(yàn)操作，且繁殖周期短，在醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，常應(yīng)用于藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥物安全性評(píng)價(jià)等方面的實(shí)驗(yàn)研究[6]。

本試驗(yàn)選擇生長和代謝都較為穩(wěn)定的成年食蟹猴作為實(shí)驗(yàn)猴[7]，通過飼喂高脂膳食飼料形成高脂血癥動(dòng)物模型，該模型形成時(shí)間相對(duì)較長，與人類長期高脂膳食導(dǎo)致的高脂血癥相似。脂代謝紊亂是誘發(fā)高脂血癥的關(guān)鍵原因，血清中TC、HDL、LDL、TG的含量可在一定程度反映機(jī)體脂肪代謝狀況，是監(jiān)測血脂變化的重要指標(biāo)[8]。TC體內(nèi)含量過量時(shí)會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利的影響；HDL主要功能是將肝外組織中過多的膽固醇運(yùn)輸?shù)礁闻K代謝，HDL具有防止動(dòng)脈粥樣硬化、降低冠心病病死率作用；LDL是所有血漿脂蛋白中首要的致動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白，如果血液中LDL含量過高，就易沉積于動(dòng)脈血管壁，會(huì)形成粥樣斑塊，導(dǎo)致血管狹窄或破裂可直接導(dǎo)致急性心梗、中風(fēng)甚至猝死。本實(shí)驗(yàn)通過檢測TC、HDL、LDL、TG的水平來衡量血脂變化情況。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在飼喂高脂膳食飼料4個(gè)月時(shí)，試驗(yàn)組TC和LDL水平極顯著升高(P<0.01)，在后期有所下降，但都穩(wěn)定維持在一個(gè)較高的水平，且TC 和LDL的水平明顯高于食蟹猴血脂的正常水平[9-11]；HDL和TG水平先增加后降低，雖然與實(shí)驗(yàn)前相比有極顯著的上升(P<0.01)，但均維持在食蟹猴血脂的正常水平；在實(shí)驗(yàn)8個(gè)月、18個(gè)月時(shí)模型組TC、HDL、LDL、TG均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)尤其是TC和LDL的水平，這一結(jié)果與楊鳳梅等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[11]。造成這些結(jié)果的可能機(jī)制是因?yàn)楦咧攀筹暳现泻?5%的豬油、30%的糖和0.5%膽固醇，高脂肪、高糖和高TC的攝入使造模動(dòng)物體內(nèi)血液的TC含量急劇增加，出現(xiàn)TC代謝障礙從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的血脂代謝紊亂，使LDL的代謝也出現(xiàn)障礙并在體內(nèi)蓄積，從而使造模動(dòng)物出現(xiàn)高TC和高LDL血癥。通過分析TG的結(jié)果可知，飼喂高脂膳食飼料動(dòng)物的TG水平，個(gè)體間存在較大差異，造成這一結(jié)果的原因可能是動(dòng)物個(gè)體間基因存在差異，有些動(dòng)物的基因在特定的身體條件和環(huán)境因素作用下會(huì)發(fā)生突變。有全基因組研究發(fā)現(xiàn)，TG代謝極端異常的HTG患者，脂蛋白(lipoprotein lipase, LPL)基因，載脂蛋白C2基因有突變聚集傾向[12]。脂蛋白脂肪酶的主要生理功能是水解血液中富含甘油三脂脂蛋白中的三脂酰甘油，生成的甘油和脂肪酸可供組織氧化分解并提供能量[13]。有些LPL 自身變異并結(jié)合遺傳因素或者環(huán)境因素時(shí)會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床癥狀，比如妊娠后,LPL 基因發(fā)生突變，TG由3.4 mmol/L 升高至22.5 mmol/L[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，采用高脂膳食飼料建立的食蟹猴高脂血癥動(dòng)物模型前期表現(xiàn)為TC和LDL迅速升高，后期雖有下降，但都維持在較高的異常水平，這一結(jié)果表明食蟹猴在造模過程中可能存在一個(gè)機(jī)體內(nèi)適應(yīng)的過程，通過體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)血脂水平，維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平；HDL和TG水平先增加后降低，但都在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。通過各項(xiàng)指標(biāo)分析，用高脂飼料建立的食蟹猴高脂動(dòng)物模型符合高脂血癥臨床分類中的高膽固醇血癥和高LDL血癥的特征，并且在18個(gè)月的試驗(yàn)監(jiān)測中，TC和LDL都維持在較高水平，說明本試驗(yàn)已經(jīng)初步建立了穩(wěn)定的食蟹猴高脂血癥動(dòng)物模型。