劉甦蘇 霍桂桃 王辰飛 范昌發(fā)

(1.中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629)(2.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心，北京 100176)

肝纖維化是機(jī)體對各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)，呈現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率特征。四氯化碳(carbon tetrachloride， CCl4)誘導(dǎo)肝臟纖維化是目前常用的造模方法，本法建立的肝纖維化模型已廣泛用于研究肝纖維化的細(xì)胞及分子機(jī)制、血清學(xué)標(biāo)志物、組織病理及抗纖維化物質(zhì)的藥效評價(jià)[1-2]。

目前國內(nèi)多采用SD大鼠和封閉群小鼠進(jìn)行CCl4急性肝毒性實(shí)驗(yàn)，選取的給藥途徑、劑量、時(shí)間間隔等因素也多有不同[3-6]。近交系小鼠具有遺傳背景均一、對藥物反應(yīng)的一致性好、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，被廣泛用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等研究中[7-8]。建立穩(wěn)定可靠的肝纖維化模型可以為肝纖維化發(fā)病機(jī)制研究、抗肝纖維化藥物的篩選及評價(jià)提供工具。因此，本研究選擇常用C57BL/6小鼠品系，摸索最適造模劑量和方法方式，建立穩(wěn)定、個(gè)體差異小的近交系C57BL/6小鼠的肝纖維化模型，為肝癌致病機(jī)理及臨床醫(yī)學(xué)研究工作提供穩(wěn)定的疾病模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：近交系C57BL/6小鼠,由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所繁殖，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2017-0005。小鼠生產(chǎn)繁育在SPF級(jí)屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在清潔級(jí)環(huán)境中進(jìn)行，飼喂SPF級(jí)小鼠顆粒飼料，飲用滅菌自來水。

本實(shí)驗(yàn)在中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.1.2主要儀器及試劑：本實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備有全自動(dòng)生化分析儀(URIT-8260)，自動(dòng)包埋機(jī)(日本櫻花 TEC5EMJ-2型) 滑動(dòng)式切片機(jī)(日本櫻花 IVS-410 型)等； CCl4、橄欖油均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AST、ALT 檢測試劑均購自中生北控生物科技股份有限公司；其他常見生化試劑如乙醇、異戊醇、苯、氯仿購自北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1肝纖維化模型分組及給藥劑量：選取5周齡的C57BL/6近交系小鼠，每組5只。CCl4和橄欖油根據(jù)體積比混合，配置成20%(高劑量10 μL/g體質(zhì)量)及10%(中劑量10 μL/g、低劑量5 μL/g)的CCl4溶液，對實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行每周2次腹腔注射，連續(xù)注射8周，對照組給予同體積橄欖油。

1.2.2觀察指標(biāo)

1.2.2.1 體質(zhì)量及生存率觀察

每周稱量小鼠體質(zhì)量，注射后注意觀察一般情況并記錄動(dòng)物情況，例如精神狀況和飲食量及小鼠體質(zhì)量。

1.2.2.2 生化指標(biāo)測定

各組小鼠分別在給藥后1周、3周、6周、8周，通過眼球內(nèi)眥靜脈叢取血， 3 000 r/min離心10 min，分離血清后用全自動(dòng)生化分析儀測定其ALT、 AST的水平。

1.2.2.3 肝臟組織病理學(xué)檢查

連續(xù)給藥8周后處死小鼠，先眼內(nèi)眥采血，待小鼠死亡，解剖，取肝臟置于4%的甲醛固定, 切片厚度3～5 μm，石蠟包埋，蘇木精一伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 近交系C57BL/6小鼠生存率的比較

為了獲得近交系品系的肝纖維化模型，并驗(yàn)證給藥劑量對成模率和生存率的影響，分別設(shè)置了高、中、低三個(gè)劑量組。給藥24 h，小鼠存活率100%，未出現(xiàn)明顯臨床病理癥狀。高劑量組1周后，大量小鼠死亡，存活率僅為20%，而中、低劑量組，以及對照組小鼠均存活到8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，僅對照組有1只小鼠注射后第2天死亡，該鼠大體剖檢顯示XXX地方有損傷跡象，推測其與給藥操作不當(dāng)有關(guān)。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，CCl4給藥劑量與小鼠模型生存率呈劑量效應(yīng)，小鼠生存率結(jié)果(見圖1)。

2.2 近交系小鼠肝纖維化形成過程中血清轉(zhuǎn)氨酶水平的動(dòng)態(tài)變化

本實(shí)驗(yàn)比較了各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ALT和AST含量，結(jié)果顯示小鼠血清ALT和AST在給藥后出現(xiàn)兩頭高、中間低的趨勢，并未隨造模時(shí)間的推進(jìn)而逐漸升高，分析原因造模后一周的ALT和AST含量急劇升高，可能與藥物急性毒性有關(guān)，隨后8周時(shí)高、中、低劑量組的轉(zhuǎn)氨酶水平升高，說明肝功能的損傷程度與注射濃度成正比，并在一定程度上反映肝纖維化的程度。ALT和AST升高，可能為肝細(xì)胞受損、微膽管梗阻所致。高劑量組指標(biāo)與對照組相近，可能是存活的小鼠未造模成功。中、低劑量組的結(jié)果顯示造模后8周，與對照組相比，小鼠血清中ALT和AST的水平升高明顯，提示肝臟的合成功能受到了損害[9]。

圖1 近交系C57BL/6小鼠各劑量組的生存率Fig.1 The survival rate of C57BL/6 mice in different each dosage group

圖2 各劑量組近交系C57BL/6小鼠給藥后 不同時(shí)間血清轉(zhuǎn)氨酶水平注：縱坐標(biāo)是各組小鼠血清ALT、AST的每L血清中水平，橫坐標(biāo)是給藥時(shí)間；給藥1周和8周，ALT、AST含量升高，與對照組相比差異極顯著(**P<0.01)；3周和6周差異不明顯(**P>0.01)，與對照組相比(**P<0.01)。Fig.2 The serum examination results of C57BL/6 mice in different times after administrationNote：The vertical coordinate is the level of ALT and AST in each group, and the horizontal coordinate is the time of administration. After 1 and 8 weeks of administration, ALT and AST content increased, indicates(**P<0.01) compared with the control group, while there was no significant difference between 3 weeks and 6 weeks (**P> 0.01), but indicates(**P<0.01) compared with the control group.

2.3 小鼠肝纖維化病理學(xué)改變

給予CCl48周后，高劑量組小鼠肝臟的主要病理學(xué)改變?yōu)闃O輕度肝細(xì)胞變性/壞死,極輕度中央靜脈周圍/匯管區(qū)混合細(xì)胞浸潤；極輕度肝臟纖維化。中劑量組小鼠肝臟的主要病理學(xué)改變?yōu)闃O輕度至輕度肝細(xì)胞變性/壞死，輕度中央靜脈周圍/匯管區(qū)混合細(xì)胞浸潤；極輕度肝臟纖維化。低劑量組小鼠肝臟的主要病理學(xué)改變?yōu)闃O輕度至輕度肝細(xì)胞變性/壞死；輕度至中度中央靜脈周圍/匯管區(qū)混合細(xì)胞浸潤；極輕度至肝臟纖維化(見圖3)。

圖3 肝纖維化小鼠肝臟病理學(xué)改變(×200)注：A：對照組肝臟未見明顯的病理學(xué)改變；B、C、D：高、中、低劑量組小鼠肝臟可見中央靜脈/匯管區(qū)混合細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞變性/壞死及纖維化。Fig.3 The liver pathology of fibrosis mice with HE stain(×200)Note: A: There were no obvious pathological changes in the liver of the control group; B, C, D: mixed inflammatory cell infiltrate, hepatocellular degeneration/necrosis and fibrosis in the central vein/portal area were observed in the liver of the high, medium and low dose groups.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量動(dòng)物組動(dòng)物死亡率為80%，剩余的一只動(dòng)物鏡檢發(fā)現(xiàn)病變。低，中劑量組未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，但是鏡檢發(fā)現(xiàn)中劑量組的病變程度高于低劑量組，存在藥物劑量效應(yīng)。隨著給藥時(shí)間增長，肝臟的中央靜脈周圍/匯管區(qū)混合細(xì)胞浸潤及肝臟纖維化程度加重。

3 討論

肝纖維化動(dòng)物模型的建立是研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室嘗試近交系C57BL/6小鼠作為研究對象，采用常用的誘導(dǎo)肝損傷模型的四氯化碳化學(xué)試劑通過給予小鼠高、中、低劑量，觀察其對肝纖維化模型建立的影響，以探索建立小鼠肝纖維化模型的方法。結(jié)果顯示，隨CCl4濃度增高，高劑量組小鼠死亡率偏高，中、低劑量組小鼠8周后肝臟出現(xiàn)纖維化，中劑量組的肝組織病變程度高于低劑量組。

肝纖維化時(shí)常伴隨肝功能損傷， 檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)指標(biāo)和肝臟組織病理學(xué)診斷方可確定是否發(fā)生肝纖維化。因此本實(shí)驗(yàn)檢測了AST、ALT等反映肝功能變化的指標(biāo)。重復(fù)結(jié)果表明，給藥8周后小鼠血清AST、ALT水平升高，且中劑量組的含量高于低劑量組，說明肝功能的損傷程度與注射濃度成正比，并在一定程度上反映肝纖維化的程度[10-11]。

綜上所述，通過注射10%CCl4，10 μL/g，共8周能夠明顯地誘導(dǎo)小鼠肝纖維化形成，且死亡率較低，是一種較理想的制作肝纖維化模型的方法，這為研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。