李 玲,張敬竟,王桂瑛,*,程志斌,谷大海,徐志強,普岳紅,葛長榮,廖國周,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,云南昆明 650201)

宣威火腿和金華火腿是我國最具代表性的發(fā)酵肉制品,其中宣威火腿以“烏金”豬為原料,產(chǎn)于云南省宣威市,其年平均溫度為13～14 ℃,而金華火腿以“兩頭烏”豬為原料,產(chǎn)于浙江省金華市,年平均氣溫為17～25 ℃[1]。由于兩地區(qū)氣候條件的影響,宣威火腿和金華火腿脂肪水解程度必然存在一定的差異,從而形成各自截然不同的特征風味。風味是決定干腌火腿品質(zhì)的重要指標之一,風味受多種因素影響,包括原料[2-4]、腌制劑[5]、加工時間的長短[6]、成熟時間以及溫度[7]、貯藏時間以及溫度[8]、包裝[9]和微生物等。游離脂肪酸是風味形成的前體物質(zhì),由火腿脂肪在加工過程中水解產(chǎn)生,其含量與組成對干腌火腿揮發(fā)性風味物質(zhì)產(chǎn)生有重要貢獻。醇、醛、酮、烷烴等多種風味物質(zhì)可以通過脂肪氧化得到。Huan等[10]的研究表明,金華火腿風味物質(zhì)中約50%的風味成分直接來源于脂肪氧化;在脂肪水解的過程中,短鏈脂肪酸會產(chǎn)生令人不愉悅的氣味而長鏈脂肪酸并不會產(chǎn)生不愉快的氣味,適宜濃度的不同風味物質(zhì)可以產(chǎn)生人們喜愛的各種風味[11]。

施忠芬等[12]通過GC-MS測出成熟宣威火腿肌間脂肪和皮下脂肪中不飽和脂肪酸相對含量較高,分別占總脂肪酸含量的64.78%和63.47%,主要的脂肪酸為油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸。閆文杰等[13]研究表明,金華火腿皮下脂肪中飽和脂肪酸的含量(56.6%)明顯高于肌間脂肪中飽和脂肪酸的含量(45.4%),肌間脂肪中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量則高于皮下脂肪中的含量。雖然目前對于干腌火腿中游離脂肪酸組成已有相關(guān)報道,但針對相同加工時間的宣威火腿與金華火腿中游離脂肪酸的含量進行絕對定量的比較尚未見報道。此外,分析技術(shù)進步也給風味物質(zhì)的研究提供了技術(shù)保障,特別是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析技術(shù)的發(fā)展[14],使得畜產(chǎn)品加工由簡單的粗加工向精細加工方向發(fā)展。本研究以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)對一年陳宣威火腿和金華火腿的肌內(nèi)脂肪與皮下脂肪中游離脂肪酸含量進行定量測定,旨在分析兩者間游離脂肪酸組成及含量差異,為進一步深入探討宣威火腿與金華火腿特征風味形成機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

宣威火腿、金華火腿 以宣威烏金豬、金華兩頭烏豬為原料,分別委托云南省宣威市順達火腿食品有限公司、浙江省金華市金字火腿股份有限公司按照當?shù)貍鹘y(tǒng)加工工藝生產(chǎn),均為一年陳火腿(2015年11月～2017年11月),各6條腿;正己烷 色譜純,TEDIA公司;甲醇 色譜純,Fisher Scientific公司;濃硫酸 分析純,開封東大化工有限公司;正己烷 分析純,國藥化學試劑公司;無水乙醚 分析純,國藥化學試劑公司;冰醋酸 分析純,國藥化學試劑公司;氯化鈉 分析純,國藥化學試劑公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 分析純,國藥化學試劑公司;高純氦氣 99.9999%,武漢紐瑞德特種氣體有限公司;37種混合脂肪酸甲酯 色譜純,Sigma公司。

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;DB-225毛細管柱(10 m×0.1 mm×0.1 μm) 美國Agilent公司;HH-4水浴鍋 常州澳華公司;5415R離心機 德國eppendorf公司;XW-80A渦旋儀 上海滬西分析儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 火腿樣品脂肪酸提取分離及甲酯化

1.2.1.1 樣品預處理 分別取30 mg股二頭肌部位的宣威火腿肌內(nèi)脂肪、宣威火腿皮下脂肪、金華火腿肌內(nèi)脂肪、金華火腿皮下脂肪4份樣品,迅速放入液氮速凍,在液氮條件下將凍好的組織樣本研磨成粉,在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 游離脂肪酸的提取分離 準確稱量火腿樣本20 mg,加入1.2 mL正己烷,渦旋1 min;30 ℃下超聲10 min;20 ℃,8000 r/min離心2 min,取上清液備用;裝置SPE小柱,5 mL正己烷活化小柱;取上清液1 mL加入SPE小柱中;分別使用正己烷∶無水乙醚(75∶25,V/V)9 mL,無水乙醚∶冰醋酸(95∶5,V/V)12 mL 依次沖洗SPE小柱,頂空瓶收集第二次沖洗的洗脫液,氮氣吹干。

1.2.1.3 脂肪酸甲酯化 氮氣吹干后的樣品中加入2 mL體積比為5%的濃硫酸/甲醇溶液,25 μL質(zhì)量比為0.2%的BHT/甲醇溶液;壓蓋,渦旋1 min;90 ℃下水浴1.5 h;取出放置,冷卻至室溫后開蓋;加入1 mL色譜純正己烷,2 mL飽和氯化鈉溶液,重新壓蓋,渦旋60 s;靜置15 min,取上清液備用;取100 μL上清液供GC-MS分析。

1.2.1.4 質(zhì)控(QC)樣本的制備及GC-MS處理 取甲酯化后多余上清液,混勻,作為QC樣本,用來檢驗儀器的精密度不穩(wěn)定性。采樣前先采3針QC樣本,用于監(jiān)測儀器精密度,間隔8個樣本采集一針QC用于監(jiān)測儀器穩(wěn)定性。

GC條件:毛細管柱Agilent DB-225(10 m×0.1 mm×0.1 μm);進樣口溫度250 ℃;接口溫度230 ℃;進樣量1 μL;分流比60∶1;柱流量0.2 mL/min。升溫程序:55 ℃保持1 min,以30 ℃/min升溫到205 ℃,205 ℃保持1 min再以5 ℃/min升溫到230 ℃保持1 min。

MS條件:離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;溶劑延遲1 min;檢測范圍30～400 Da;SIM離子選擇 55、67、74、79、87;保持時間25 ms。

定性及定量:配制不同濃度梯度的27種脂肪酸標準品,根據(jù)標準品濃度(X)與其在譜圖中的峰面積(y),每個脂肪酸計算出一條y=ax+b的擬合曲線;根據(jù)每個脂肪酸的特征碎片離子,對各個樣本進行定性,然后根據(jù)定性脂肪酸的峰面積,將其帶入擬合曲線,計算得到對應脂肪酸的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用獨立性T-test進行顯著性分析,結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示,EXCEL 2010軟件進行圖表處理與制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 火腿中游離脂肪酸的氣相色譜圖

通過GC-MS對宣威火腿和金華火腿肌內(nèi)與皮下的游離脂肪酸進行測定,總離子流圖如圖2所示。對混合標準樣品游離脂肪酸的種類進行檢測,結(jié)果如圖1所示,37種游離脂肪酸能得到較好的分離。根據(jù)以上方法對火腿樣品進行檢測,最終定性定量得到了22種游離脂肪酸,如圖2所示。

圖1 37種游離脂肪酸標準品氣相色譜圖

圖2 宣威火腿樣本皮下游離脂肪酸總離子流圖

圖3 金華火腿樣本皮下游離脂肪酸總離子流圖

2.2 宣威火腿與金華火腿肌內(nèi)脂肪中游離脂肪酸含量比較

宣威火腿和金華火腿肌內(nèi)游離脂肪酸的含量及組成如表1所示。宣威火腿和金華火腿肌內(nèi)分別檢出22種游離脂肪酸,棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸是肌內(nèi)主要的4種游離脂肪酸。金華火腿棕櫚酸(8.00 μg/mg)、硬脂酸(6.88 μg/mg)、油酸(7.42 μg/mg)含量高于宣威火腿(5.76、5.11、3.39 μg/mg)，且差異顯著(p<0.05)。宣威火腿和金華火腿亞油酸含量分別為2.13、3.35 μg/mg。

表1 宣威火腿與金華火腿肌內(nèi)脂肪中游離脂肪酸含量與組成(μg/mg)Table 1 Free fatty acid content and composition in intramuscular fat of Xuanwei ham and Jinhua ham(μg/mg)

就游離脂肪酸總量而言,金華火腿含量達到29.24 μg/mg,是宣威火腿(19.13 μg/mg)的1.53倍,存在顯著差異(p<0.05)。2種火腿的飽和脂肪酸(∑SFA)含量在各自的肌內(nèi)脂肪總含量中所占比例最大,比值均在50%以上,宣威火腿所占比例(60.64%)顯著高于金華火腿所占比例(54.24%)(p<0.05);金華火腿肌內(nèi)脂肪單不飽和脂肪酸(∑MUFA)含量為8.26 μg/mg,是宣威火腿(3.79 μg/mg)的1.18倍,其多不飽和脂肪酸(∑PUFA)含量是最少的,為5.12 μg/mg,是宣威火腿(3.75 μg/mg)的1.37倍。金華火腿必需脂肪酸(∑EFA)含量(4.74 μg/mg)高于宣威火腿(3.50 μg/mg),宣威火腿與金華火腿的肌內(nèi)PUFA/SFA比值均為0.32。

2.3 宣威火腿與金華火腿皮下脂肪中游離脂肪酸含量比較

宣威火腿和金華火腿皮下游離脂肪酸的含量及組成如表2所示。宣威火腿和金華火腿肌內(nèi)游離脂肪酸分別檢出22種游離脂肪酸,棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸是皮下脂肪主要的4種游離脂肪酸,與肌內(nèi)脂肪相同。金華火腿棕櫚酸(22.91 μg/mg)含量較宣威火腿(18.32 μg/mg)高25.05%,且差異顯著(p<0.05);金華火腿硬脂酸(15.39 μg/mg)含量高于宣威火腿(10.71 μg/mg):宣威火腿和金華火腿油酸含量分別為27.14、35.80 μg/mg,亞油酸含量分別為14.08、16.07 μg/mg。金華地區(qū)氣溫較宣威地區(qū)高,對脂肪氧化水解有利,導致金華火腿游離脂肪含量高于宣威火腿含量。

表2 宣威火腿與金華火腿皮下脂肪中游離脂肪酸的含量與組成(μg/mg)Table 2 Free fatty acid content and composition in subcutaneous fat of Xuanwei ham and Jinhua ham(μg/mg)

就游離脂肪酸總量而言,金華火腿含量達到102.68 μg/mg,較宣威火腿(79.54 μg/mg)提高了29.09%。2種火腿∑SFA含量在各自的皮下脂肪總含量中的所占比例也最大,宣威火腿比例為39.94%,金華火腿的比例為40.52%,與肌內(nèi)脂肪相比有所降低;這2種火腿的皮下脂肪∑MUFA含量與肌內(nèi)脂肪比較有所增加,分別為30.65、40.54 μg/mg,∑PUFA所占比例也分別增加為21.52%、22.60%。∑EFA含量與肌內(nèi)脂肪相比,宣威火腿含量增加至15.10 μg/mg,金華火腿增加至17.60 μg/mg。宣威火腿與金華火腿的皮下PUFA/SFA比值分別增加至0.54、0.45。

3 討論

脂肪酸含量對干腌火腿的風味形成和營養(yǎng)價值有較大影響。干腌火腿呈現(xiàn)出不同的脂肪含量,這是由于豬的品種和原料遺傳特性的差異造成的[15]?；鹜戎兄|(zhì)的水解除了與原料有關(guān),還與用鹽量、內(nèi)源酶活力、加工時間長短和溫濕度有很大的關(guān)系[16]。宣威火腿的原料是以肉質(zhì)鮮美的烏金豬為原料,金華火腿是以皮薄骨細、精多肥少的兩頭烏豬為原料。宣威火腿發(fā)酵成熟期間平均溫度為18～20 ℃,平均濕度為71%～74%;金華火腿的成熟期平均溫度高達25～29 ℃,平均濕度為78%～81%。兩地溫濕度有一定差異,金華地區(qū)平均氣溫較高,對脂肪分解較有利,其火腿游離脂肪酸含量高于宣威火腿。游離脂肪酸是脂肪的分解產(chǎn)物,火腿中脂肪的水解主要在酶的作用下進行。國內(nèi)外對干腌火腿加工過程中脂肪分解氧化規(guī)律以及風味形成機理進行了研究:Vestergaard等[11]以Parma火腿為分析測定對象,研究了其在加工過程中脂肪水解酶活力和游離脂肪酸的變化,結(jié)果表明脂肪酸的含量與鮮肉中酸性和中性脂肪酶活性呈正相關(guān);章建浩等[17]研究發(fā)現(xiàn),金華火腿低溫腌制階段各種游離脂肪酸無顯著增加,進入中溫發(fā)酵過程中有極顯著增加(p<0.01)。本試驗中,金華火腿肌內(nèi)總游離脂肪酸含量為29.24 μg/mg,皮下脂肪總游離脂肪酸含量為90.83 μg/mg,均高于宣威火腿中的含量(19.13、79.54 μg/mg)。主要原因為金華火腿加工過程中溫濕度較高,進一步促進了火腿后熟過程中脂肪酶的活性提高或脂肪酶含量的增加,促進脂肪水解轉(zhuǎn)變成游離脂肪酸,導致相同加工時間內(nèi)金華火腿的游離脂肪酸含量較高,并進一步引起風味的差異,這也是金華火腿為何表現(xiàn)出濃香型,而宣威火腿表現(xiàn)出清香型的特征風味差異的重要原因。

根據(jù)脂肪的不同存在形式可以將脂類物質(zhì)分為皮下脂肪、肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪,因在分離提取過程中肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪很難被分開,所以廣義上也將這兩種脂肪統(tǒng)稱為肌內(nèi)脂肪[18]。彭聰?shù)萚19]研究表明,18個月的成熟宣威火腿皮下脂肪中不飽和脂肪酸的相對含量較高,占總脂肪酸含量的56.88%,主要的脂肪酸為油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸。朱健輝[20]研究發(fā)現(xiàn),在一級金華火腿中皮下脂肪中飽和、單不飽和脂肪酸以及游離脂肪酸總量高于肌內(nèi)脂肪,造成這一結(jié)果的原因是水解酶的活力差異以及兩個部位間脂肪組成不同。在本試驗中宣威火腿皮下脂肪中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的60.06%,肌內(nèi)脂肪中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的39.41%,金華火腿皮下脂肪中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的59.47%,肌內(nèi)脂肪中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的45.71%。金華火腿不飽和脂肪酸高于宣威火腿,金華火腿中水解酶活力高于宣威火腿。

營養(yǎng)學家除了考慮食品中脂肪酸的相對含量、單個脂肪酸含量以及n-6/n-3多不飽和脂肪酸的比例外,PUFA/SFA也成為重要的參考指標[21]。食品中PUFA/SFA的比率大于0.4被認為是健康食品[22],而干腌火腿中PUFA/SFA的比率在0.17～0.35。本試驗中,宣威火腿和金華火腿肌內(nèi)脂肪PUFA/SFA的比率均為0.32,皮下脂肪PUFA/SFA的比率分別為0.54、0.45,皮下脂肪的比率略高于干腌火腿PUFA/SFA的建議范圍。

4 結(jié)論

宣威火腿和金華火腿肌內(nèi)游離脂肪酸總含量分別為19.13、29.24 μg/mg,皮下游離脂肪酸總含量分別為79.54、102.68 μg/mg。宣威火腿和金華火腿皮下飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量高于肌肉飽和脂肪酸含量。從脂肪酸的組成來看,宣威火腿和金華火腿肌肉脂肪和皮下脂肪分別檢測出22種游離脂肪酸,主要的脂肪酸均為棕櫚酸、硬脂酸、油酸與亞油酸。肌內(nèi)脂肪中宣威火腿棕櫚酸含量為5.76 μg/mg,硬脂酸含量為5.11 μg/mg,油酸含量為3.39 μg/mg,和金華火腿相應含量差異顯著(p<0.05);皮下脂肪中金華火腿棕櫚酸含量為22.91 μg/mg,是宣威火腿的1.25倍,硬脂酸含量為15.39 μg/mg,是宣威火腿的1.44倍,油酸含量為35.80 μg/mg,是宣威火腿的1.32倍。

兩種火腿不同部位游離脂肪酸含量的差異也決定了發(fā)酵一年的兩種火腿的風味差異。其一年陳的金華火腿的肌內(nèi)、肌間游離脂肪酸含量均高于宣威火腿,這可能與其發(fā)酵的環(huán)境具有顯著相關(guān)性,同時發(fā)酵環(huán)境中的微生物種群組成、發(fā)酵溫度和濕度等因素起著重要作用,后期可從游離脂肪酸種類及含量差異出發(fā),解析發(fā)酵工藝條件與游離脂肪酸、感官風味三者之間的聯(lián)系,確定不同火腿特征風味成分的形成機制。本研究對兩種火腿不同部位的游離脂肪酸的測定可為兩種火腿特征風味差異提供較好的參考數(shù)據(jù),便于進一步解析兩種火腿風味差異的作用機制,同時也可為后期火腿加工工藝及發(fā)酵條件改善,提高風味品質(zhì)提供參考。