周婷婷,陳盧濤,周 敏,俞璐萍,劉小羽,黎 斌,胡晉峰,朱萌萌,*

(1.綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司,浙江杭州 310000;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)/茶與食品科技學(xué)院/茶葉生物與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230036)

乙烯利又名2-氯乙基磷酸,是一類(lèi)人工合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,在植物體內(nèi)可以通過(guò)釋放乙烯來(lái)參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的各種生理過(guò)程,比如可以催熟西瓜、蘋(píng)果、梨等水果,使柿子催熟脫澀,促進(jìn)棉花增花,使小麥、水稻等作物秸稈矮化等[1]。由于乙烯利屬于低毒類(lèi)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,近年來(lái),乙烯利在果蔬催熟中被廣泛使用,已有研究表明,長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人的健康和生命造成一定的危害,一定濃度的乙烯利可引起局部及頭腦腎損害,導(dǎo)致中樞麻痹,加速人體衰老[2]。歐盟對(duì)乙烯利在葡萄、桔子、桑葚等水果、蘿卜、番茄、黃瓜等蔬菜中的最大殘留限量均為0.05 mg/kg;美國(guó)對(duì)乙烯利在番茄中的最大殘留限量為2.0 mg/kg;我國(guó)《GB 2763-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定乙烯利在辣椒、番茄中的最大殘留限量分別為2.0、5.0 mg/kg,在葡萄、哈密瓜中的最大殘留限量為1.0 mg/kg,在獼猴桃、荔枝、芒果、香蕉、菠蘿中的最大殘留限量為2.0 mg/kg。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)果蔬中乙烯利檢測(cè)分析方法主要有頂空氣相色譜法結(jié)合氫火焰離子檢測(cè)器(HS/GC-FID)[3-6],此類(lèi)方法易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。另外一類(lèi)方法是將乙烯利用重氮甲烷進(jìn)行甲基化衍生化后形成乙烯利二甲酯,結(jié)合氣相色譜火焰光度檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)(GC-FPD)[7],而重氮甲烷在制備和存儲(chǔ)過(guò)程中易燃易爆,且具有較強(qiáng)的毒性和刺激性,但其反應(yīng)速度快,效率高,產(chǎn)生雜質(zhì)少。近幾年液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)較多地用于乙烯利等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)分析[8-10],但需要特殊的色譜柱及洗脫條件,不具有一定的普遍適用性。此外三甲基硅重氮甲烷[11]、N,O-雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)[12]也常用于乙烯利的衍生化反應(yīng)檢測(cè)分析中。衍生化試劑MTBSTFA反應(yīng)性較強(qiáng),衍生物揮發(fā)性較好,易與羥基、羧羥基、一級(jí)胺和二級(jí)胺中的活潑氫反應(yīng),不與脂肪酸反應(yīng);可形成特丁基二甲基硅的衍生物,其在質(zhì)譜中易失去特丁基形成高豐度[M-57]+特征離子,適于MS定量分析,已廣泛用于硝基苯酚、癸醇、二羧酸等化合物的衍生化反應(yīng)[13]。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)具有定性準(zhǔn)確度高、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、定量測(cè)定靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品、食品、土壤等樣品中農(nóng)藥殘留、塑化劑、多氯聯(lián)苯等化合物的分析檢測(cè)。本文擬采用衍生化試劑N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)、N,O-雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)結(jié)合GC-MS/MS方法對(duì)果蔬中乙烯利化合物殘留量進(jìn)行檢測(cè)分析,并比較其差異,旨在探究一種操作簡(jiǎn)單、檢出限低、靈敏度高的前處理及衍生化方法,用于果蔬中痕量乙烯利化合物殘留量的檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙烯利標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥96.0%,德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司;N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)硅烷化試劑 純度≥97.0%,美國(guó)Regis公司;MTBSTFA+1% t-BDMCS 純度≥95.0%,美國(guó)Regis公司;N,O-雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)硅烷化試劑 純度≥99.0%,美國(guó)Regis公司;甲醇 色譜純,美國(guó)J T Baker公司;甲苯、鹽酸、無(wú)水乙醚、吡啶、苯 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)室所用水 均為去離子水;微孔有機(jī)濾膜(0.22 μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:GC-2010 plus-TQ8040,VF-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 日本Shimadzu公司;ST-16R型離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher 公司;BSA2202S型電子天平 德國(guó)Sartorius公司;漩渦混合器 美國(guó)Henry Troemner 公司;KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;AutoEVA-20L型全自動(dòng)平行濃縮儀 福建?？苾x器有限公司;CHK-121型臺(tái)式精密酸度計(jì) 北京昌科儀自動(dòng)化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取及衍生化 參考文獻(xiàn)[13]的方法,以水果、蔬菜樣品為研究對(duì)象,先將樣品切碎混勻均一化制成勻漿,然后稱取制備好的試樣10.00 g于50 mL聚乙烯離心管中,加入20.0 mL提取溶劑甲醇,渦旋器振蕩1.0 min,加入一定體積的鹽酸水溶液(V/V=1∶1,調(diào)節(jié)pH),在200 W功率下超聲提取20 min,在5000 r/min下離心3.0 min,取上清液于50.0 mL聚乙烯容量瓶中,殘?jiān)俅渭尤?0.0 mL甲醇,在200 W功率下超聲提取20 min,合并提取液于50.0 mL聚乙烯容量瓶中,用甲醇定容至50.0 mL,待衍生。

取10.0 mL萃取液于15 mL聚乙烯離心管中,在35 ℃水浴條件下緩緩氮吹至液面不再下降,即甲醇全部揮發(fā),向離心管中加入5.0 mL無(wú)水乙醚,渦旋3.0 min,靜置10 min,將乙醚層液體轉(zhuǎn)移至另一聚乙烯離心管中,殘留液加入5.0 mL無(wú)水乙醚,重復(fù)提取一次,合并提取液,35 ℃水浴條件下緩緩氮?dú)獯抵烈颐淹耆珦]發(fā)。向該離心管中加入100 μL甲苯,渦旋30 s,加入衍生化試劑MTBSTFA 10 μL,渦旋30 s后,蓋嚴(yán)塞子,60 ℃水浴反應(yīng)30.0 min后,用甲苯定容至1.0 mL,渦旋后過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜,進(jìn)GC-MS/MS分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及衍生化 稱取乙烯利0.0101 g,用色譜純甲醇定容至25.0 mL,得到387.84 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;用甲醇稀釋為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于0～4 ℃保存。

取一定體積的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至于具塞離心管中,緩緩氮?dú)獯抵良状纪耆珦]發(fā),向該離心管中加入100 μL甲苯,渦旋30 s,加入10 μL衍生化試劑MTBSTFA,其余步驟同1.2.1衍生化過(guò)程,圖1為乙烯利與MTBSTFA的衍生化反應(yīng)原理。由于MTBSTFA對(duì)水分敏感,在與乙烯利反應(yīng)前必須除去樣品中的痕量水,主要是通過(guò)和甲醇重復(fù)共蒸發(fā)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖1 乙烯利與MTBSTFA的衍生化反應(yīng)

1.2.3 提取條件的優(yōu)化

1.2.3.1 提取溶劑的選擇 乙烯利具有較強(qiáng)的極性和親水性,在水中的溶解度大于1000 g/L,易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚,微溶于苯和二氯乙烷,不溶于石油醚,常用的提取溶劑有水、甲醇、乙醇、丙酮等。由于MTBSTFA對(duì)水分敏感,不能用水作為乙烯利的提取劑,本試驗(yàn)考察了甲醇、乙醇和丙酮3種提取溶劑對(duì)乙烯利提取效果的影響。按照1.2.1節(jié)所述方法分別加入3種提取溶劑:甲醇、乙醇和丙酮進(jìn)行提取,加入衍生化試劑MTBSTFA 10 μL,用甲苯定容至1.0 mL,渦旋后過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜,檢測(cè)回收率。

1.2.3.2 提取pH的優(yōu)化 乙烯利在室溫、pH<3.0的條件下比較穩(wěn)定,本試驗(yàn)以甲醇為提取溶劑,MTBSTFA作為衍生化試劑,比較了不同pH條件下的提取效率。稱取10.00 g葡萄樣品,加入20.0 mL甲醇,渦旋器振蕩1.0 min,加入一定體積的鹽酸水溶液(V/V=1∶1,調(diào)節(jié)pH),調(diào)節(jié)樣品溶液pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,按照1.2.1節(jié)所述方法進(jìn)行提取和衍生,用甲苯定容至1.0 mL,渦旋后過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜,檢測(cè)回收率。

1.2.4 衍生化條件的優(yōu)化

1.2.4.1 衍生化試劑的考察 幾種硅烷化試劑如N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA,CAS:24589-78-4)、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA,CAS:25561-30-2)常用于磷酸或羧酸基團(tuán)的衍生化反應(yīng)[15],但MTBSTFA在衍生化產(chǎn)物的得率和重復(fù)性上效果較其它衍生化試劑要好。本試驗(yàn)比較了BSTFA、MTBSTFA和MTBSTFA+1% t-BDMCS三種衍生化試劑用于乙烯利衍生化反應(yīng)的優(yōu)劣。在3個(gè)具塞離心管中分別加入10.0 mg/L的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.1 mL,在常溫條件下,氮?dú)饬骶従彺蹈捎袡C(jī)溶劑,向離心管中加入100 μL甲苯,渦旋30 s,分別加入衍生化試劑BSTFA、MTBSTFA和MTBSTFA+1% t-BDMCS 10 μL,渦旋30 s后,蓋嚴(yán)塞子,60 ℃水浴反應(yīng)30.0 min后,用甲苯定容至1.0 mL,渦旋后過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜,檢測(cè)乙烯利衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)。

1.2.4.2 衍生化試劑添加量的優(yōu)化 對(duì)衍生化試劑MTBSTFA添加量進(jìn)行了優(yōu)化,在6個(gè)具塞離心管中分別加入10.0 mg/L的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.1 mL,在常溫條件下,氮?dú)饬骶従彺蹈捎袡C(jī)溶劑,分別添加衍生化試劑MTBSTFA 5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μL,按1.2.1操作過(guò)程進(jìn)行衍生化反應(yīng),并將最終體積定容為1.0 mL上機(jī)分析,檢測(cè)乙烯利衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)。

1.2.4.3 衍生化溫度的優(yōu)化 對(duì)衍生化溫度進(jìn)行了優(yōu)化,向5個(gè)具塞離心管中分別加入10.0 mg/L的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.1 mL,在常溫條件下,氮?dú)饬骶従彺蹈捎袡C(jī)溶劑,分別設(shè)置衍生化溫度為40、50、60、70、80 ℃,按1.2.1操作過(guò)程進(jìn)行衍生化反應(yīng),并將最終體積定容為1.0 mL上機(jī)分析,檢測(cè)乙烯利衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)。

1.2.4.4 衍生化時(shí)間的優(yōu)化 對(duì)衍生化時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,向6個(gè)具塞離心管中分別加入10.0 mg/L的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.1 mL,在常溫條件下,氮?dú)饬骶従彺蹈捎袡C(jī)溶劑,分別設(shè)置衍生化時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min,按1.2.1操作過(guò)程進(jìn)行衍生化反應(yīng),并將最終體積定容為1.0 mL上機(jī)分析,檢測(cè)乙烯利衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)。

1.2.5 儀器條件

1.2.5.1 色譜條件 進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣:高純氦氣;碰撞氣:高純氬氣,純度≥99.999%;柱流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣,1.0 min后開(kāi)閥;進(jìn)樣量:1 μL;定量方法:外標(biāo)法;升溫程序:80 ℃保持0 min,以40 ℃/min升至250 ℃,保持0 min,以20 ℃/min升至290 ℃,保持3.75 min。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 色譜-質(zhì)譜接口溫度:280 ℃;電離方式:EI;電離能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃;檢測(cè)器電壓:0.99 kV(+0.4 kV);測(cè)定方式:MRM多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;定性、定量離子、碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 乙烯利質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 The MS/MS parameters of ethephon

1.2.6 方法學(xué)考察

1.2.6.1 基質(zhì)效應(yīng)(ME) 由于食品樣本基質(zhì)背景復(fù)雜,且前處理過(guò)程用到大量有機(jī)試劑、酸和衍生化試劑,可能對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)產(chǎn)生一定的影響,基質(zhì)效應(yīng)成為影響分析結(jié)果的精確度和精密度的關(guān)鍵因素,為了提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度,本實(shí)驗(yàn)按照添加法定量評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度[16]的方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察,分別選取不含乙烯利的4種蔬菜空白樣品:蘿卜、西葫蘆、辣椒、番茄,4種水果空白樣品:葡萄、草莓、香蕉、油桃,按1.2.1前處理方法處理后,通過(guò)測(cè)定空白提取液與純?nèi)軇┲刑砑酉嗤瑵舛?濃度:1.00 mg/kg)分析物的離子響應(yīng)強(qiáng)度,考察不同基質(zhì)條件對(duì)乙烯利化合物響應(yīng)的影響,ME的計(jì)算公式如下:

式中:A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積;B為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液峰面積。

1.2.6.2 線性范圍、檢出限和定量限 采用相應(yīng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)定量,配制成0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L 6個(gè)質(zhì)量濃度的乙烯利化合物,以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別在空白基質(zhì)中添加0.200和0.600 μg/kg的乙烯利,按1.2.1前處理方法處理后,測(cè)試其信噪比,分別確定檢出限和定量限,以信噪比S/N≥3得到目標(biāo)物的檢出限(LOD),以信噪比S/N≥10得到目標(biāo)物的定量限。

1.2.6.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 向7個(gè)具塞離心管中加入10.0 mg/L的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.1 mL,按1.2.1操作過(guò)程進(jìn)行衍生化反應(yīng),并將最終體積定容為1.0 mL,分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣1.0 μL,測(cè)定乙烯利衍生物峰面積,計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6.4 添加回收實(shí)驗(yàn) 稱取市售的蘿卜、辣椒、葡萄、草莓、香蕉5個(gè)空白樣品中進(jìn)行3個(gè)水平的添加回收實(shí)驗(yàn),添加濃度分別為:0.0100、0.0200和0.0500 mg/kg,每個(gè)添加水平重復(fù)3次,按照1.2.1節(jié)所述方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)日本Shimadzu公司的GCMS solution軟件、Excel軟件及美國(guó)GraphPad公司的GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計(jì)分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

在所選提取溶劑用量一致的情況下,分別選擇甲醇、乙醇和丙酮作為提取溶劑。結(jié)果表明,丙酮的提取效率明顯低于甲醇、乙醇,而甲醇和乙醇的提取效率接近(圖2)?？紤]到丙酮毒性較甲醇、乙醇大,且丙酮提取基質(zhì)中的色素等雜質(zhì)較多,會(huì)對(duì)后續(xù)凈化效果產(chǎn)生一定的影響;甲醇沸點(diǎn)較乙醇低,在氮吹過(guò)程中可節(jié)約樣品前處理時(shí)間,綜合考慮,選擇甲醇作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對(duì)萃取效果的影響(n=6)

2.2 提取pH的選擇

乙烯利的穩(wěn)定性受pH的影響較大,在以甲醇作為提取溶劑的條件下,考察了乙烯利在不同pH提取條件下的回收率(見(jiàn)圖3),結(jié)果表明,當(dāng)乙烯利在pH<4.0的條件下進(jìn)行萃取,回收率均在80.0%以上,且較為穩(wěn)定;在pH為4.0時(shí),回收率達(dá)到最大;隨著pH的升高,當(dāng)pH為5.0、6.0時(shí),回收率持續(xù)下降,可能是由于乙烯利在pH>4.0的溶液中存在部分降解,導(dǎo)致回收率偏低且不穩(wěn)定。綜合考慮,選擇pH為4.0的萃取溶液環(huán)境。

圖3 pH對(duì)萃取效果的影響(n=6)

2.3 衍生化試劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)最初采用BSTFA用于乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的衍生化反應(yīng),衍生后進(jìn)GC-MS/MS分析,發(fā)現(xiàn)乙烯利經(jīng)BSTFA衍生后,產(chǎn)物的重復(fù)性較差,在進(jìn)樣口若使用硅烷化、未添加玻璃棉的襯管,RSD<20%;若使用未硅烷化、添加玻璃棉的襯管,RSD>50%,可能一方面是因?yàn)槲垂柰榛r管表面的硅醇基極易和樣品發(fā)生作用,另一方面是因?yàn)锽STFA衍生后產(chǎn)物不穩(wěn)定,導(dǎo)致重復(fù)性較差,這與Purdon的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的[17]。本實(shí)驗(yàn)后采用MTBSTFA和MTBSTFA+1% t-BDMCS用于乙烯利標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的衍生化反應(yīng),且衍生化效率用峰面積來(lái)表示(見(jiàn)圖4),結(jié)果表明,乙烯利經(jīng)MTBSTFA衍生后產(chǎn)物的峰面積是經(jīng)MTBSTFA+1% t-BDMCS衍生后產(chǎn)物響應(yīng)的1.16倍左右,說(shuō)明使用不含1% t-BDMCS的MTBSTFA結(jié)合GC-MS/MS法更適合乙烯利的檢測(cè)分析,這與Young等人使用MTBSTFA對(duì)環(huán)烷酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)得到的結(jié)論一致[18]。

圖4 MTBSTFA+1% t-BDMCS與MTBSTFA對(duì)衍生化效率的影響(n=6)

2.4 衍生化試劑添加量選擇

衍生化反應(yīng)一般受衍生化試劑量的影響較大,在衍生化試劑MTBSTFA不同添加量的條件下,考察衍生化效率用用峰面積來(lái)表示(見(jiàn)圖5),結(jié)果表明,當(dāng)MTBSTFA的添加量為5.0 μL時(shí),乙烯利衍生后產(chǎn)物的峰面積最小,隨著MTBSTFA添加量的增加,乙烯利衍生后產(chǎn)物的響應(yīng)逐漸提高,當(dāng)MTBSTFA的添加量為10.0 μL時(shí),乙烯利衍生后產(chǎn)物的峰面積最大,當(dāng)添加量>10.0 μL時(shí),衍生后產(chǎn)物峰面積有所降低并呈穩(wěn)定趨勢(shì)。為保證衍生化反應(yīng)完全,并綜合考慮試驗(yàn)成本,選擇MTBSTFA的添加量為10.0 μL。

圖5 衍生化試劑添加量對(duì)衍生化效率的影響(n=3)

2.5 衍生化試劑溫度選擇

乙烯利是化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的一種化合物,可以通過(guò)堿水緩慢釋放出,在室溫或中等堿性條件下,乙烯利的降解比較緩慢,在pH為9的條件下,乙烯利的半衰期僅為1 d,但隨著pH和溫度的升高,乙烯利會(huì)發(fā)生明顯的降解[13]。在設(shè)置不同衍生化溫度的條件下,且衍生化效率用峰面積來(lái)表示(見(jiàn)圖6),結(jié)果表明,當(dāng)衍生化溫度為40 ℃時(shí),乙烯利衍生后產(chǎn)物的響應(yīng)最小;隨著衍生化溫度的升高,乙烯利衍生后產(chǎn)物的響應(yīng)逐漸提高;當(dāng)衍生化溫度為60 ℃時(shí),衍生后產(chǎn)物響應(yīng)達(dá)到最高;衍生化溫度繼續(xù)升高時(shí),乙烯利衍生后產(chǎn)物的響應(yīng)又略有降低,可能是由于溫度升高,乙烯利發(fā)生部分降解,導(dǎo)致衍生后產(chǎn)物響應(yīng)降低,溫度越高,降解越明顯。綜合考慮,選擇衍生化溫度為60 ℃。

2.6 衍生化試劑時(shí)間選擇

在設(shè)置不同衍生化時(shí)間的條件下,且衍生化效率用峰面積來(lái)表示(見(jiàn)圖7),結(jié)果表明,當(dāng)衍生化時(shí)間為10 min時(shí),乙烯利衍生后產(chǎn)物的響應(yīng)最小;隨著衍生化時(shí)間的延長(zhǎng),乙烯利衍生后產(chǎn)物的響應(yīng)逐漸提高;當(dāng)衍生化時(shí)間為30～60 min時(shí),衍生后產(chǎn)物響應(yīng)最高并趨于穩(wěn)定,考慮日常檢測(cè)樣品的效率,選擇衍生化時(shí)間為30 min。

圖7 衍生化時(shí)間對(duì)衍生化效率的影響比較(n=3)

2.7 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電子轟擊離子源(EI)檢測(cè)模式下對(duì)乙烯利衍生后產(chǎn)物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析(Q3 Scan),在質(zhì)譜圖中選擇質(zhì)荷比較大,絕對(duì)強(qiáng)度較大的離子為前體離子(見(jiàn)圖7),M/Z為315的碎片離子相對(duì)強(qiáng)度最高;M/Z為287和245的碎片離子相對(duì)強(qiáng)度次之,故選擇315、287和245共3個(gè)碎片離子作為前體離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描。設(shè)定3～45 eV(每3 eV一個(gè)間隔)的碰撞能量,對(duì)選定的前體離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(產(chǎn)物離子掃描),根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖,離子強(qiáng)度最大的245被選擇為定量離子,離子強(qiáng)度次之的287和167被選為定性離子。圖8、圖9分別為使用優(yōu)化后的氣相色譜質(zhì)譜條件采集乙烯利衍生后產(chǎn)物的MRM質(zhì)譜圖和色譜圖。

圖8 乙烯利硅烷化衍生物的全掃描質(zhì)譜圖

圖9 乙烯利MRM色譜圖

2.8 基質(zhì)效應(yīng)的考察

本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定空白提取液與純?nèi)軇┲刑砑酉嗤瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度,考察了在添加1.00 mg/kg條件下,不同基質(zhì)條件對(duì)乙烯利化合物響應(yīng)的影響。結(jié)果表明(見(jiàn)圖10),乙烯利衍生后產(chǎn)物在不同基質(zhì)中均存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),在蘿卜、西葫蘆、辣椒、番茄中A/B<1.2,基質(zhì)干擾程度較低。在葡萄、草莓、香蕉中A/B>1.2,說(shuō)明存在中等程度的基質(zhì)干擾效應(yīng)。在水果中的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)于在蔬菜中的基質(zhì)效應(yīng),可能是由于水果中富含葡萄糖、果糖、蔗糖、有機(jī)酸、果膠等多種成分,在前處理過(guò)程中未得到有效的凈化,而一般熱極性、不穩(wěn)定、具有氫鍵結(jié)果能力的農(nóng)藥在氣相色譜殘留分析中較易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。在基質(zhì)效應(yīng)存在的情況下,本試驗(yàn)選取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,可以一定程度上降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

圖10 不同基質(zhì)對(duì)乙烯利的基質(zhì)效應(yīng)影響(n=3)

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,以儀器響應(yīng)峰面積對(duì)目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,線性關(guān)系良好(R2≥0.999)。在空白基質(zhì)中添加0.200、0.600 μg/kg的乙烯利,按1.2.1前處理方法處理后,以信噪比S/N≥3得到目標(biāo)物的檢出限(LOD),以信噪比S/N≥10得到目標(biāo)物的定量限,具體見(jiàn)表2。檢出限、定量限分別為0.200、0.600 μg·kg-1。

表2 乙烯利衍生化化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficient,limit of determination(LOD) and limit of quantitation(LOQ)of ethephon derivatization compound

2.6 穩(wěn)定性

通過(guò)測(cè)定供試樣品溶液中乙烯利0、2、4、6、8、10、12 h內(nèi)濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),其值為2.1%,表明供試樣品溶液中乙烯利衍生物在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 回收率、精密度

通過(guò)在不同基質(zhì)樣品中添加0.0100、0.0200和0.0500 mg/kg三個(gè)濃度水平的乙烯利,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定3次,其平均回收率范圍為81.3%～105.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.4%,具體結(jié)果(見(jiàn)表3)。

表3 乙烯利加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Recoveries and RSD of ethephon

3 結(jié)論

本文比較了衍生化試劑BSTFA、MTBSTFA、MTBSTFA+1% t-BDMCS用于乙烯利衍生化反應(yīng)的差異,并對(duì)前處理方法及儀器色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在pH為4.0的條件下,以甲醇作為提取溶劑,采用MTBSTFA在添加量為10 μL、60 ℃條件下衍生反應(yīng)30.0 min,結(jié)合GC-MS/MS進(jìn)行分析檢測(cè),取得較好的效果。在0.1～1.0 mg/L的濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,決定系數(shù)大于0.999,檢出限為0.200 μg/kg,定量限為0.600 μg/kg,在三個(gè)不同添加水平下的平均回收率為81.3%～105.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.4%。優(yōu)化后的方法操作簡(jiǎn)便,反應(yīng)溫和,同時(shí)避免使用易燃易爆,且具有較強(qiáng)的毒性和刺激性的重氮甲烷進(jìn)行衍生,可用于水果、蔬菜中乙烯利的定量檢測(cè)。