唐 川,楊 銘,盧 軒

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116622)

隨著人們對(duì)食品質(zhì)量及其安全要求的提高,只起到簡(jiǎn)單隔絕作用的傳統(tǒng)食品包裝已不能滿足人們的需求。具有抑菌、抗氧化等功能的包裝材料逐漸受到關(guān)注,這些活性包裝材料通常采用“基質(zhì)材料+活性物質(zhì)”的策略[1-3]?；|(zhì)材料多為生物相容性及生物可降解性聚合物,如聚乳酸(PLA)、聚羥基脂肪酸酯(PHA)、聚己內(nèi)酯(PCL)等人工合成高分子材料及目前研究更為廣泛的淀粉類、纖維素類、殼聚糖類等天然高分子材料;活性物質(zhì)多采用具有抑菌、抗氧化作用的丁香酚、香芹酚、百里香酚、肉桂醛等天然植物提取物[4-6]。殼聚糖(chitosan,CS)是甲殼素經(jīng)脫乙酰得到的產(chǎn)物,來源廣泛價(jià)格低廉,具有良好的生物相容性和生物可降解性,且成膜性好、可食用,作為基質(zhì)材料在食品領(lǐng)域研究廣泛[7-9]。肉桂醛(cinnamaldehyde,CI)是一種天然醛類化合物,廣泛存在于肉桂等植物內(nèi),具有較強(qiáng)的抑菌作用,是良好的天然抑菌劑[10]。將肉桂醛負(fù)載于基質(zhì)材料中是制備抑菌材料的一種有效策略[11-13]。

目前,將活性物質(zhì)負(fù)載于基質(zhì)材料中的方法主要有溶液浸漬法和直接混入法。這些方法在處理過程中會(huì)使用大量有機(jī)溶劑或需要在較高溫度下操作,易導(dǎo)致活性物質(zhì)失活、分布不均勻和產(chǎn)品有機(jī)溶劑殘留等問題。超臨界溶液浸漬法(supercritical solution impregnation,SSI)是一種將小分子物質(zhì)通過超臨界二氧化碳(SC-CO2)負(fù)載到基質(zhì)材料中的技術(shù)[14]。SSI操作條件溫和,對(duì)環(huán)境友好,不改變基質(zhì)材料結(jié)構(gòu),且活性物質(zhì)負(fù)載量可通過調(diào)節(jié)過程參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié),在食品工業(yè)中具有極大應(yīng)用潛力。但目前SSI在食品包裝中的研究較少,國內(nèi)還未見報(bào)導(dǎo),并且國外的研究多集中于合成高分子包裝材料中活性物質(zhì)的負(fù)載,天然高分子包裝材料中活性物質(zhì)的負(fù)載研究較少,相關(guān)研究亟待開展[15-16]。

本研究擬通過SSI過程將肉桂醛負(fù)載至殼聚糖膜(chitosan film,CSF)中,制備得到CI-CSF抑菌包裝材料。對(duì)CI-CSF的肉桂醛負(fù)載量、形貌、水蒸氣透過率、結(jié)晶性、不透明度以及抑菌性能進(jìn)行考察,探索SSI過程制備食品活性包裝的應(yīng)用潛力,為SSI過程制備食品活性包裝的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(CS,脫乙酰度85.0%,黏度154 mPa·s) 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司;肉桂醛(CI,純度>95.0%) 生工生物工程(上海)股份有限公司;CO2(食品級(jí),純度>99.9%) 大連永豐氣體有限公司;冰醋酸、甘油(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphlycoccusaureus) 大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院。

SFE-500MR-2-FMC10 SSI裝置 美國Waters公司;S-4800型掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Magna-550Ⅱ型紅外光譜儀 美國尼高力公司;X’Pert RPD型X射線衍射儀 荷蘭PANalvital公司;DNP-9162型恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DZF-6021型真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖膜的制備 殼聚糖基質(zhì)膜采用溶液澆注法制備,制備方法如下:將殼聚糖原料溶解于1% V/V醋酸水溶液中,形成4% W/V的殼聚糖溶液,并向殼聚糖溶液中加入甘油作為塑化劑至1% V/V;取殼聚糖溶液50 mL倒入100 mm×100 mm的Teflon方皿中,45 ℃下干燥過夜,脫模后即得殼聚糖膜。得到的殼聚糖膜密封保存于干燥皿中備用。

1.2.2 SSI過程負(fù)載肉桂醛 采用SSI過程制備負(fù)載肉桂醛殼聚糖膜(CI-CSF),SSI過程設(shè)備如圖1所示。SSI流程參照本課題組之前的研究[17]:殼聚糖膜包裹于濾紙中置于高壓釜攪拌槳上部,肉桂醛加入至高壓釜底部,不與殼聚糖膜直接接觸,肉桂醛加入量可保證高壓釜內(nèi)超臨界二氧化碳(SC-CO2)達(dá)到飽和;CO2經(jīng)冷卻槽冷卻至0 ℃,通過高壓泵送入高壓釜中,高壓釜中壓力和溫度分別由高壓泵及加熱夾套控制,待壓力和溫度達(dá)到設(shè)定值后,浸漬2 h;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,關(guān)閉高壓泵,打開泄壓閥,以一定速率進(jìn)行泄壓;最終取出樣品置于密封袋中,保存于干燥皿中,等待進(jìn)一步的表征。本研究考察浸漬溫度40 ℃,浸漬時(shí)間2 h條件下,浸漬壓力(10、15 MPa)及泄壓速度(1、5 MPa/min)對(duì)肉桂醛在殼聚糖膜中的負(fù)載量的影響。

圖1 SSI過程示意圖

1.2.3 CI-CSF形貌的表征 CI-CSF的形貌采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行表征。將CI-CSF樣品裁剪成適宜大小片狀,通過碳膠帶固定于樣品臺(tái)上,CI-CSF截面樣品采用剪刀進(jìn)行切割后通過碳膠帶固定于樣品臺(tái)上,樣品在真空環(huán)境下,噴金處理20 s后,加速電壓5.0 kV下,進(jìn)行掃描電子顯微鏡表征,觀察其形貌。采用螺旋測(cè)微儀對(duì)CI-CSF膜厚進(jìn)行測(cè)量,在CI-CSF上任意取5點(diǎn)進(jìn)行厚度測(cè)量,結(jié)果取平均值。

1.2.4 CI-CSF負(fù)載量的測(cè)定 CI-CSF中肉桂醛負(fù)載量采用分光光度法測(cè)定[18]。取50 mg的CI-CSF浸于10 mL乙醇中,超聲功率600 W下處理30 min,使負(fù)載的肉桂醛全部溶解于乙醇中。隨后樣品溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后濾液于290 nm處測(cè)定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(A=0.06428C+0.01814,A為吸光值,C為肉桂醛濃度,單位mg/L,R2=0.9991)計(jì)算得到負(fù)載的肉桂醛質(zhì)量。CI-CSF負(fù)載量(loading capacity,LC)定義為負(fù)載的CI質(zhì)量與CSF質(zhì)量之比。

1.2.5 CI-CSF水蒸氣透過率(WVP)的測(cè)定 CI-CSF水蒸氣透過率按照ASTME96-90標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定[19]。選用直徑40 mm的透濕杯,內(nèi)裝3 g無水氯化鈣,用CI-CSF將透濕杯口覆蓋并密封固定,稱重后置于干燥器中。干燥器中盛有飽和氯化鈉溶液保持相對(duì)濕度75%,并置于30 ℃培養(yǎng)箱中。每12 h稱量一次,記錄透濕杯質(zhì)量的增加量,根據(jù)式1計(jì)算水蒸氣透過率:

式(1)

式中,ΔW/Δt為單位時(shí)間內(nèi)增加的水的質(zhì)量(g/s);l為CI-CSF厚度(m);A為有效的擴(kuò)散面積(m2);ΔP為CI-CSF兩側(cè)的水蒸氣滲透壓差(Pa)。

1.2.6 CI-CSF不透明度的測(cè)定 CI-CSF不透明度按照文獻(xiàn)中方法進(jìn)行測(cè)定[6]。將樣品膜裁剪成4 cm×1 cm大小,貼在比色皿一側(cè),采用可見分光光度計(jì)以空白比色皿為參比于600 nm處測(cè)定其吸光度,不透明度(Opacity)由式2計(jì)算:

式(2)

式中,A600為600 nm處樣品吸光度;l為樣品厚度(mm)。

1.2.7 CI-CSF結(jié)晶性的測(cè)定 CI-CSF結(jié)晶性通過X射線衍射儀進(jìn)行表征,工作電壓40 kV,管電流40 mA,Cu靶,Ni過濾片Kα發(fā)射,掃描范圍5～60 °,掃描速度5 °/min。

1.2.8 CI-CSF抑菌性的測(cè)定 通過抑菌圈法對(duì)CI-CSF的抑菌性能進(jìn)行考察[17]。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)8 h進(jìn)行活化,活化后在Tryptic Soy Agar(TSA)平板上培養(yǎng)得到單菌落。挑取單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)8 h。將菌液稀釋10 倍,取200 μL涂布于TSA平板,然后將直徑為10 mm的CI-CSF置于平板上,于37 ℃下培養(yǎng)24 h,測(cè)量CI-CSF抑菌圈大小。同時(shí)取空白CSF作為陰性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中所有實(shí)驗(yàn)均平行三次或三次以上。數(shù)據(jù)均以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。數(shù)據(jù)圖采用Origin 7.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 CI-CSF負(fù)載量

CI-CSF中肉桂醛負(fù)載量結(jié)果如表1所示,CI-CSF中肉桂醛的負(fù)載量在1.64%～2.44%范圍內(nèi),浸漬壓力15 MPa,泄壓速度1 MPa/min時(shí)負(fù)載量最大,為2.44%。由結(jié)果可見,在同一壓力下,泄壓速度為1 MPa/min時(shí),CI-CSF負(fù)載量大于泄壓速度為5 MPa/min時(shí)的CI-CSF負(fù)載量。這是由于在較低泄壓速度下,肉桂醛從SC-CO2中析出負(fù)載于殼聚糖膜中;在較高的泄壓速度下,溶解有肉桂醛的SC-CO2更加傾向于離開殼聚糖膜,最終導(dǎo)致肉桂醛的負(fù)載量降低。并且在較高浸漬壓力下,這種現(xiàn)象更加明顯,這可能是由于在較高壓力時(shí),肉桂醛在SC-CO2中的溶解度也更大[20],泄壓時(shí)隨SC-CO2擴(kuò)散出殼聚糖膜的肉桂醛也更多。從結(jié)果中還可以看出,在相同的泄壓速度下,CI-CSF的負(fù)載量隨壓力變化不明顯,這說明SSI過程中泄壓速度對(duì)肉桂醛在CI-CSF中負(fù)載量影響更大。

表1 CI-CSF負(fù)載量、厚度、水蒸氣透過率、不透明度結(jié)果Table 1 LC,thickness,WVP and opacity of CI-CSF results

2.2 CI-CSF形貌

SSI過程前后殼聚糖膜形貌如圖2所示。圖2中(a)、(b)為溶液澆注法制備得到殼聚糖膜表面及截面圖,(c)、(d)為SSI過程(15 MPa、1 MPa/min)制備得到的CI-CSF樣品表面及截面圖。由結(jié)果可見,CSF表面平整光滑,經(jīng)過SSI過程負(fù)載肉桂醛后,CI-CSF表面較平整,但出現(xiàn)鱗狀結(jié)構(gòu),這可能是由于肉桂醛負(fù)載至CSF中,使殼聚糖分子鏈之間產(chǎn)生間隙,并且SSI過程泄壓時(shí)壓力的變化使殼聚糖表面產(chǎn)生輕微剝離現(xiàn)象,因此表面產(chǎn)生鱗狀結(jié)構(gòu)。但由圖2(b)、(d)截面圖可見,SSI過程前后CSF截面并未出現(xiàn)明顯變化,這可能是由于殼聚糖分子鏈之間的間隙較小,難以在SEM圖片中觀察到。截面SEM圖片中出現(xiàn)擠壓及變形現(xiàn)象,這是由于CSF及CI-CSF截面樣品制備時(shí),采用剪刀進(jìn)行切割導(dǎo)致的,SSI過程前后CSF和CI-CSF截面形貌并未發(fā)生明顯變化。由圖2(c)可見,CI-CSF樣品表面無明顯肉桂醛附著,結(jié)合CI-CSF負(fù)載量結(jié)果可知,SSI過程肉桂醛的負(fù)載并不是簡(jiǎn)單地析出附著在殼聚糖膜表面,而是由SC-CO2將肉桂醛溶解后,擴(kuò)散進(jìn)入殼聚糖膜中,泄壓后均勻析出分散于殼聚糖膜中,這一結(jié)果也與之前的研究結(jié)果相符[21]。

圖2 CSF及CI-CSF掃描電鏡圖

2.3 CI-CSF水蒸氣透過率及不透明度

CI-CSF水蒸氣透過率結(jié)果如表1所示。采用SSI過程負(fù)載肉桂醛制備得到的CI-CSF與空白CSF相比,水蒸氣透過率明顯升高。雖然肉桂醛的疏水性質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致CI-CSF的水蒸氣透過率降低,但是結(jié)合CI-CSF的SEM結(jié)果可知,CI-CSF表面SEM圖片中可觀察到輕微剝離現(xiàn)象,這可能是由于肉桂醛在CI-CSF中的負(fù)載使得殼聚糖分子間產(chǎn)生間隙,并且SC-CO2在泄壓過程中使得CSF中產(chǎn)生微小的空隙,但這種空隙較小,未在CI-CSF截面SEM圖片種直接觀察到,在這些因素共同作用下,使得CI-CSF的水蒸氣透過率增大[22],同時(shí)也使得CI-CSF的不透明度顯著增加。

2.4 CI-CSF X射線衍射譜圖

SSI過程浸漬前后CSF和CI-CSF的XRD譜圖如圖3所示。由圖3中(a)可知,CSF衍射角在20 °附近出現(xiàn)衍射峰,說明殼聚糖具有晶體結(jié)構(gòu)。SSI過程負(fù)載肉桂醛后,CI-CSF在10 °附近出現(xiàn)較弱的衍射峰,且衍射峰較寬,說明晶粒尺寸較小,這一現(xiàn)象也與文獻(xiàn)中的結(jié)果相似[23]。

圖3 CSF及CI-CSF的X射線衍射譜圖

2.5 CI-CSF抑菌性能

肉桂醛可破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜,影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng),進(jìn)而抑制細(xì)菌的繁殖[24]。采用SSI過程制備的負(fù)載肉桂醛的CI-CSF,其抑菌性能對(duì)其應(yīng)用具有重要意義。本研究采用抑菌圈法考察了CI-CSF對(duì)兩種常見食源性細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制情況,結(jié)果如表2所示。CI-CSF對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用,且對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌。并且由表2可見,隨著CI-CSF中肉桂醛負(fù)載量的增加,對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng),這是由于肉桂醛對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用具有濃度依賴性,因此負(fù)載量大的CI-CSF具有更好的抑菌性能?？瞻證SF未展示出對(duì)供試菌的生長(zhǎng)抑制作用,說明CI-CSF對(duì)供試菌的生長(zhǎng)抑制作用源于其中負(fù)載的肉桂醛。

表2 CI-CSF對(duì)供試菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition cycle of CI-CSF on two bacterias

3 結(jié)論與討論

本研究以CSF為基質(zhì),肉桂醛為抑菌物質(zhì),通過SSI過程將肉桂醛負(fù)載至CSF中制備CI-CSF用于抑菌包裝材料。通過調(diào)節(jié)SSI過程參數(shù),可對(duì)CI-CSF中肉桂醛負(fù)載量進(jìn)行調(diào)節(jié),泄壓速度對(duì)肉桂醛在CI-CSF中負(fù)載量影響較大,浸漬壓力15 MPa、泄壓速度1 MPa/min條件下,CI-CSF中肉桂醛的負(fù)載量最高為2.44%。SSI過程后CI-CSF表面較平整,水蒸氣透過率和不透明度較空白CSF均有升高。CI-CSF對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有抑制作用。采用SSI方法將肉桂醛負(fù)載于CSF中制備CI-CSF,過程條件溫和且避免了有機(jī)溶劑的使用,所得CI-CSF具有良好的抑菌效果,在食品活性包裝領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。