馬詩(shī)文,高 云,*,韓思楊,湯 梅,陳 如,李彤彤,方志剛,陸永禎

(1.遼寧科技大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,遼寧鞍山 114051;2.遼寧科技大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)中心,遼寧鞍山 114051)

綠豆又稱青小豆,是豆科豇豆屬一年生草本植物綠豆的成熟種子,具有解毒消腫、消暑利尿和抗氧化作用[1]。綠豆多肽是綠豆分離蛋白經(jīng)水解而成的低聚肽混合物,由于相對(duì)分子質(zhì)量較小,具有水溶性高、黏度低、穩(wěn)定性強(qiáng)等特性[2-3],人體極易吸收,可提高機(jī)體免疫力[4-5],降低膽固醇、改善腎功能[6],還具有很強(qiáng)的抗氧化性,可作為新型抗氧化劑使用[7-8]。我國(guó)綠豆資源豐富,價(jià)格低廉,目前綠豆產(chǎn)品的深加工主要集中在綠豆淀粉的利用和生理活性物質(zhì)提取等方面[9-10],生產(chǎn)中的綠豆蛋白等副產(chǎn)物含量高,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,尚未得到充分利用,制備綠豆多肽是綠豆蛋白綜合利用的有效途徑。

優(yōu)化綠豆蛋白的水解條件是改進(jìn)制備綠豆多肽的重要方法,蛋白酶的選擇及其酶解條件對(duì)綠豆多肽的制備以及抗氧化活性有著重要的影響[11-12]。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)綠豆多肽的研究多集中在單酶水解的研究。盧珍華等[13]通過(guò)研究木瓜蛋白酶對(duì)綠豆蛋白的水解作用,確定最佳反應(yīng)條件為:酶濃度8%,底物濃度9%,反應(yīng)溫度65 ℃,反應(yīng)時(shí)間3 h,pH6.5。傅亮等[14]以堿性蛋白酶酶解制備綠豆多肽,得到最佳酶解條件下的水解度為23.09%。顧薇等[15]利用中性蛋白酶對(duì)綠豆分離蛋白進(jìn)行酶法水解以制備寡肽,水解度的平均值可達(dá)28.82%。但是以復(fù)合酶協(xié)同水解綠豆蛋白制備綠豆多肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以綠豆蛋白為原料,以水解度為控制指標(biāo),選取堿性蛋白酶及中性蛋白酶復(fù)合,提供復(fù)合酶協(xié)同水解制備綠豆抗氧化肽的最佳工藝條件,為制備綠豆多肽提供了新思路。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化綠豆蛋白酶解的最適條件,并對(duì)綠豆抗氧化肽的自由基清除能力進(jìn)行研究,為綠豆產(chǎn)品的深加工及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆蛋白 哈爾濱哈達(dá)淀粉有限公司;中性蛋白酶(酶活力50000 U/g)、堿性蛋白酶(酶活力200000 U/g) 安琪酵母股份有限公司;DPPH Sigma公司;氫氧化鈉、甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、Tris-HCl緩沖溶液、鄰苯三酚、VC國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

FA2004N型電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司;DF-101型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 北京世紀(jì)森朗實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PHSJ-5型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;DT5-1型低速離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;722S型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆抗氧化多肽制備工藝流程 配制一定濃度的綠豆分離蛋白水溶液,控制溫度值為85 ℃水浴保溫15 min。達(dá)到反應(yīng)溫度值后,調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值,冷卻到酶適宜溫度保溫。加入水解所需的蛋白酶,將得到的水解液放入水浴鍋中進(jìn)行恒溫酶解反應(yīng)。反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間取出置于沸水浴中加熱15 min以滅酶。將滅酶后的酶解液冷卻至40 ℃,于離心機(jī)中以4000 r/min離心分離15 min,取出上清液待用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 pH對(duì)酶解效果的影響 在底物濃度為8%、酶解溫度為54 ℃、酶用量為4%等條件相同的情況下,調(diào)節(jié)pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復(fù)合對(duì)綠豆蛋白進(jìn)行水解,水解3 h,以水解度為指標(biāo),考察pH對(duì)酶解效果的影響。

1.2.2.2 溫度對(duì)酶解效果的影響 在底物濃度為8%、pH為8.0、酶用量為4%等條件相同的情況下,分別在酶解溫度為46、48、50、52、54、56、58 ℃時(shí),用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復(fù)合對(duì)綠豆蛋白溶液進(jìn)行水解,水解時(shí)間為3 h,以水解度為指標(biāo),考察酶解溫度對(duì)酶解效果的影響。

1.2.2.3 底物濃度對(duì)酶解效果的影響 在pH為8.0、酶解溫度為54 ℃、酶用量為4%等條件相同的情況下,用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復(fù)合對(duì)綠豆蛋白溶液進(jìn)行水解,分別改變底物濃度為4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,水解時(shí)間為3 h,以水解度為指標(biāo),考察底物濃度對(duì)酶解效果的影響。

行間清耕、間作小麥、自然生草3個(gè)處理按照順序分別選定10株蘋果幼樹(shù)；測(cè)定2015年蘋果幼樹(shù)的定干高度、生長(zhǎng)量；2016年測(cè)定蘋果幼樹(shù)生長(zhǎng)狀況；測(cè)定蘋果幼樹(shù)中心干和分枝中部的20片葉片長(zhǎng)寬、葉柄長(zhǎng)粗及葉綠素含量等，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)定葉片長(zhǎng)寬和葉柄長(zhǎng)粗；用TYS-A型葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉片葉綠素含量，每個(gè)葉片測(cè)4個(gè)部位。在行間清耕、間作小麥、自然生草3個(gè)處理分別選6行樹(shù)，每行選一個(gè)灌溉帶，調(diào)查蘋果幼樹(shù)成花株數(shù)和每株成花樹(shù)的成花數(shù)。

1.2.2.4 酶用量對(duì)酶解效果的影響 在底物濃度為8%、pH為8.0、溫度為54 ℃等條件相同的情況下,用中性蛋白酶與堿性蛋白酶1∶1復(fù)合對(duì)綠豆蛋白溶液進(jìn)行水解,分別改變酶用量為2%、3%、4%、5%、6%、7%,水解時(shí)間為3 h,以水解度為指標(biāo),考察酶用量對(duì)酶解效果的影響。

1.2.3 復(fù)合酶加酶方式實(shí)驗(yàn) 復(fù)合酶協(xié)同水解實(shí)驗(yàn)選取催化作用效果好的中性蛋白酶及堿性蛋白酶兩種酶作為復(fù)合酶組合,按照以下水解步驟進(jìn)行:先將其中一種蛋白酶加入綠豆蛋白溶液中,考慮反應(yīng)結(jié)束后是否進(jìn)行滅酶,再加入第二種蛋白酶,水解一定時(shí)間后終止反應(yīng),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 復(fù)合酶加入方式對(duì)水解度的影響Table 1 Effect of composite enzyme addition method on hydrolysis degree

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以pH、酶解溫度、底物濃度、酶用量為影響因素,以水解度為指標(biāo),對(duì)復(fù)合水解綠豆蛋白制備綠豆多肽進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,把單因素實(shí)驗(yàn)中得出的最佳條件確定為各因素的中間水平,實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.5 水解度的測(cè)定 水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法[16]。取適量綠豆蛋白水解液,加入60 mL去CO2蒸餾水,用精密pH計(jì)調(diào)節(jié)pH為8.20,加入20 mL已中和pH為8.20的甲醛,然后用0.1000 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定pH到9.20,記下消耗NaOH的體積V1,用蒸餾水替代樣品,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn),記錄空白實(shí)驗(yàn)消耗NaOH的體積V0,并用以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)的水解度。

1.2.6 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取200 μL綠豆多肽溶液加入到5 mL 0.05 mmol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液中,用無(wú)水乙醇定容到6 mL,搖勻,在室溫下避光反應(yīng)20 min,用無(wú)水乙醇做參比在517 nm處測(cè)定吸光度A0。用無(wú)水乙醇代替5 mL DPPH溶液,測(cè)定得到的吸光度為A1,并用以下公式表示樣品對(duì)DPPH清除率[17]。

1.2.7 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定[18]。取200 μL綠豆多肽溶液,加入到5.76 mL、pH8.2的50 mmol/L Tris-HCL緩沖溶液中,振蕩混勻,在25 ℃水浴保溫10 min后加入40 μL、25 mmol/L鄰苯三酚(25 ℃水浴預(yù)熱處理),迅速混合開(kāi)始計(jì)時(shí)。測(cè)定5 min內(nèi)在320 nm處的吸光度,每隔30 s讀數(shù)一次。以蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照,分別將樣品管和對(duì)照管作吸光度隨時(shí)間變化得回歸方程,其斜率為自氧化速率。記樣品管自氧化速率為ΔA0,對(duì)照管自氧化速率為ΔA1,用以下公式表示樣品對(duì)超氧陰離子清除率。

1.2.8 羥自由基清除率的測(cè)定 采用水楊酸法測(cè)定[14]。取200 μL綠豆多肽溶液,加入到5 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵溶液和5 mL、6 mmol/L雙氧水溶液混合溶液中,搖勻后加入2 mL、6 mmol/L水楊酸溶液,混合后立即在510 nm測(cè)A0值。用蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照,測(cè)定得到的吸光度為A1。用以下公式表示樣品對(duì)羥自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin Pro 8.5進(jìn)行作圖、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手(II3.1)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響 酶的空間構(gòu)型在酸堿不適宜的情況下會(huì)產(chǎn)生變化,從而導(dǎo)致酶失活;此外,pH會(huì)影響底物與酶的解離狀態(tài),影響蛋白質(zhì)的水解程度。圖1表明,復(fù)合酶協(xié)同水解綠豆蛋白的反應(yīng)中,水解度的值會(huì)隨著pH的變化而變化。水解反應(yīng)在pH6.5～8.5的范圍之間時(shí),水解度測(cè)定結(jié)果會(huì)隨pH的增加而上升。在pH為8.5時(shí)綠豆分離蛋白水解度最高,水解效果最好。當(dāng)pH超過(guò)8.5時(shí),水解度開(kāi)始緩慢下降。說(shuō)明pH為8.5時(shí)復(fù)合酶的酶活最強(qiáng),水解效果最好。

圖1 pH對(duì)水解度的影響

2.1.2 溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響 酶促反應(yīng)中溫度過(guò)高會(huì)對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,易致酶失活,其次酶促反應(yīng)過(guò)程中,溫度會(huì)分別影響酶與底物、酶與抑制劑、激活劑、輔酶的結(jié)合。由圖2可知,不同溫度條件下,反應(yīng)水解度值表現(xiàn)不同。隨著溫度的上升水解度也在不斷升高,溫度控制為54 ℃的時(shí)候,水解綠豆蛋白得到的水解度較高,達(dá)到峰值,說(shuō)明此時(shí)水解效果最好。而溫度超過(guò)54 ℃時(shí),水解度開(kāi)始呈緩慢下降趨勢(shì),這可能是高溫影響了酶本身的活性而影響了產(chǎn)物的水解度。

圖2 溫度對(duì)水解度的影響

2.1.3 底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響 酶解反應(yīng)中,底物濃度過(guò)高會(huì)增大水解液黏度從而產(chǎn)生底物抑制作用;此外,隨著反應(yīng)底物減少,酶量過(guò)剩會(huì)導(dǎo)致水解反應(yīng)變慢。圖3表明,隨著底物濃度的增加,水解度也呈快速上升趨勢(shì),在底物濃度為10%時(shí)水解度達(dá)到最大,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)趨于平衡。綜合考慮底物濃度對(duì)底物的抑制作用,認(rèn)為復(fù)合酶水解綠豆蛋白在底物濃度為9%的時(shí)候,水解度較高,說(shuō)明此時(shí)水解效果好,其次底物濃度為10%、8%、7%、6%、5%、4%。

圖3 底物濃度對(duì)水解度的影響

2.1.4 酶用量對(duì)酶解反應(yīng)的影響 酶用量即為標(biāo)注活力/底物量,酶用量對(duì)酶與底物反應(yīng)具有促進(jìn)作用。圖4表明,加入不同酶用量酶解綠豆蛋白溶液,水解度值也有所不同。由圖4中上升趨勢(shì)可知,酶用量數(shù)值越高水解度也在增加。根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)材料的經(jīng)濟(jì)性原則,認(rèn)為選擇酶用量3%、4%、5%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 酶用量對(duì)水解度的影響

2.2 堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解水解條件的優(yōu)化

2.2.1 復(fù)合酶加入方式對(duì)酶解水解度的影響 通過(guò)堿性蛋白酶和中性蛋白酶加酶順序的差異以及加酶過(guò)程中是否進(jìn)行滅酶,將復(fù)合酶兩者比例設(shè)置為1∶1,研究復(fù)合酶加入方式對(duì)綠豆蛋白水解度的影響,復(fù)合酶加入方式對(duì)水解度的影響結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)合酶加入方式對(duì)水解度的影響Table 3 Effect of composite enzyme addition method on hydrolysis degree

由表3中數(shù)據(jù)可知實(shí)驗(yàn)序號(hào)4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最高,即堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶協(xié)同水解的最佳加酶方式為先加入堿性蛋白酶,中間不需要經(jīng)過(guò)高溫滅酶處理,再加入中性蛋白酶酶解,這種加酶方式所得的酶解物水解度最高,水解度可達(dá)到30.89%。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在上述的堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶法最佳加酶方式的條件下,對(duì)復(fù)合酶水解綠豆蛋白的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。選取A(pH)、B(溫度)、C(底物濃度)、D(酶用量)為4個(gè)因素,各取3個(gè)水平,以水解度為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4和表5所示。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results of analysis orthogonal experiment

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Result of variance analysis

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知:各個(gè)因素對(duì)雙酶協(xié)同水解反應(yīng)的水解度大小影響程度的主次關(guān)系為:A>D>B>C,即pH>酶用量>酶解溫度>底物濃度,復(fù)合酶協(xié)同水解綠豆蛋白的最佳工藝條件是A3B3C1D2,即pH為8.5、溫度56 ℃、底物濃度為8%、酶用量4%,根據(jù)此最佳工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)操作,實(shí)際測(cè)得的水解度平均值為33.95%,超過(guò)了此前各組酶解工藝水解度值。

2.3 綠豆抗氧化肽的抗氧化活性評(píng)價(jià)

抗氧化活性評(píng)價(jià)主要測(cè)定單酶水解物(為中性蛋白酶單酶水解綠豆蛋白的水解物)、復(fù)合酶水解物對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的清除率,探討綠豆多肽在3種抗氧化體系中的抗氧化作用,并以VC和綠豆蛋白作為對(duì)照。

2.3.1 綠豆抗氧化肽清除DPPH自由基能力 由圖5可知,各個(gè)樣品都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除活性,且活性均隨樣品濃度水平的提高而顯著上升。在樣品質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí),復(fù)合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物DPPH自由基的清除率達(dá)到82.8%;對(duì)于單酶水解綠豆蛋白而言,清除能力最大為79.18%。而在相同濃度下,陽(yáng)性對(duì)照VC的最大清除率為89.5%,綠豆蛋白的最大清除率為56.13%。這說(shuō)明在相同濃度下VC清除DPPH·的能力表現(xiàn)最好,其次為復(fù)合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物,單酶水解綠豆蛋白的水解物低于復(fù)合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物而高于綠豆蛋白。

圖5 綠豆多肽對(duì)DPPH·清除能力的影響

圖6 綠豆多肽對(duì)清除能力的影響

2.3.3 綠豆抗氧化肽清除羥自由基能力 由圖7可知,各個(gè)樣品對(duì)OH·均具有較好的清除能力,且清除能力均隨樣品濃度水平的提高而提高。在樣品質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí),四種樣品對(duì)OH自由基的清除率趨于平穩(wěn);陽(yáng)性對(duì)照VC的清除能力最大為69.51%,復(fù)合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物最大值為56.85%,單酶水解綠豆蛋白清除能力最大為50.24%,綠豆蛋白的最大清除率為41.62%。這說(shuō)明在相同濃度下復(fù)合酶水解綠豆蛋白的水解產(chǎn)物優(yōu)于單酶水解綠豆蛋白的水解物清除OH·的能力。兩者均低于VC,而高于綠豆蛋白。

圖7 綠豆多肽對(duì)OH·清除能力的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)合酶協(xié)同水解法制備綠豆抗氧化活性多肽,并對(duì)綠豆多肽的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)得到復(fù)合酶協(xié)同水解綠豆蛋白的最適反應(yīng)條件為pH8.5,溫度56 ℃,底物濃度8%,酶用量4%,水解度可以達(dá)到33.95%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)綠豆抗氧化多肽對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥自由基均有良好的清除能力,復(fù)合酶協(xié)同水解得到的綠豆抗氧化多肽對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥自由基清除率分別為82.8%,76.82%和56.85%,表明綠豆多肽抗氧化效果明顯,在保健食品領(lǐng)域有一定的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。