王 珊,馬挺軍

(北京農(nóng)學院食品科學與工程學院,北京 102206)

苦蕎(又稱韃靼蕎麥,Fagopyrumtataricum),是我國重要的“藥食兩用”的小宗糧食作物[1],含有較高的淀粉、豐富的蛋白質(zhì)以及多種功能活性物質(zhì)。但苦蕎中含有蛋白酶抑制劑、植酸等抗營養(yǎng)因子,這些抗營養(yǎng)因子是導致蛋白質(zhì)、淀粉消化率低,功能活性成分減少的主要原因之一[2-3]。有研究表明,苦蕎經(jīng)萌發(fā)處理,可降低蛋白酶抑制劑的含量,提高蛋白質(zhì)和淀粉的消化性,使氨基酸更為均衡,黃酮、酚酸和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)等生物活性物質(zhì)富集[4-5]?？嗍w萌發(fā)第3 d時,總淀粉含量下降不大,此時淀粉含量與大多數(shù)谷物相當,可提供碳源滿足發(fā)酵條件[6-7]。張雨薇等[8]對萌發(fā)前后蕎麥蛋白及氨基酸變化進行研究,發(fā)芽處理可顯著提高蕎麥蛋白質(zhì)含量(平均增幅50.0%)、總氨基酸含量(平均增幅37.0%)。因此,萌發(fā)蕎麥是一種較為合適的釀酒原料。

苦蕎萌發(fā)后,其營養(yǎng)價值提高,更加有利于消化吸收。隨著苦蕎開發(fā)利用,以萌發(fā)蕎麥作為發(fā)酵原料的研究逐漸增多,主要集中在萌發(fā)苦蕎酒或飲料等方面。孫常明等[9]以28 ℃培養(yǎng)3 d的萌發(fā)蕎麥為原料發(fā)酵制酒,將螞蟻提取物與蕎麥芽酒按比例勾兌獲得的保健酒口感醇厚,兼具酒香和藥香,是一種具有抗風濕功能的新型保健酒。張燕莉[10]以21 ℃發(fā)芽72 h苦蕎芽為原料發(fā)酵制得的啤酒中,γ-氨基丁酸、總黃酮、總酚酸較原料中有所提高,且明顯高于市售啤酒。尉杰[11]以23 ℃光照培養(yǎng)3 d的萌發(fā)甜蕎為原料,經(jīng)發(fā)酵獲得酒精度為13.5% vol發(fā)芽甜蕎酒,其品質(zhì)較好。黃永光等[12]以25 ℃培養(yǎng)3 d的蕎麥芽和馬尾松花粉為原料,向酒液中加入馬尾松花粉進行調(diào)配,獲得蕎麥-馬尾松花粉格瓦斯飲料,其酒精度為6.2% vol,總黃酮含量為92.916 μg/mL。前人的研究主要集中在糖化、發(fā)酵、調(diào)配等方面,未將萌發(fā)培養(yǎng)后的苦蕎與發(fā)酵釀酒結(jié)合研究。

植物受到逆境脅迫時,可刺激合成黃酮、酚酸、γ-氨基丁酸的關(guān)鍵酶活性,繼而促進活性物質(zhì)進一步積累,其中黃酮、酚酸在抗炎、抗衰老、降血糖、抑制腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用[13-16]。GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì),可改善腦機能,同時具有降血壓、利尿[17-19]等作用,同時,鹽脅迫是一種安全、環(huán)保的脅迫方式[20]。因此,本文將鹽脅迫與發(fā)酵結(jié)合,其中,萌發(fā)培養(yǎng)階段,以苦蕎為原料,考察培養(yǎng)溫度、光照時間、鹽種類及濃度對萌發(fā)3 d苦蕎中總黃酮、總酚酸影響;糖化階段,以萌發(fā)苦蕎為原料,考察糖化溫度、糖化時間以及酶添加量對DE值(還原糖含量與總干物質(zhì)含量之比)的影響，同時研究了不同發(fā)酵天數(shù)的總黃酮、總酚酸、GABA的變化趨勢,及成品酒的理化指標,以期為萌發(fā)苦蕎功能性保健酒研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黔苦1號 貴州省農(nóng)業(yè)科學院;活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;冰乙酸、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、氯化鋁、乙酸鉀、碳酸鈉 北京化工廠;硫酸銅 天津市福晨化學試劑廠;亞甲藍 北京博奧拓達科技有限公司;酒石酸鉀鈉 西隴化工股份有限公司;亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鄰苯二甲醛、乙酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;α-淀粉酶(3700 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;糖化酶(1000000 U/g) 阿拉丁(上海)有限公司;甲醛溶液(36%～38%) 國藥集團化學試劑有限公司;蘆丁標準品、沒食子酸標準品、GABA標準品、β-疏基丁醇、福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;乙腈 色譜純，美國MREDA公司。

BSA224S型電子分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;WS-01恒溫恒濕培養(yǎng)箱 湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司;TDZ5M型臺式低速離心機 長沙易達儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 邦西儀器科技(上海)有限公司;可調(diào)式封閉電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;德爾高速粉碎機、25 mL酸式滴定管、500 mL全玻璃蒸餾器、50 mL附溫度計密度瓶 上海信誼儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎種子萌發(fā)處理 選取籽粒飽滿,無霉變苦蕎種子,去離子水洗凈濾干,用1% NaClO消毒15 min,去離子水沖洗干凈,將去離子水沒過苦蕎種子并在30 ℃條件下水浴浸泡5 h。取出均勻放入平鋪有兩層紗布的托盤中。在一定溫度、光照時間、鹽種類及濃度條件下,80%±5% RH恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,在45 ℃恒溫鼓風干燥箱干燥12 h并過60目篩備用。

1.2.2 萌發(fā)苦蕎釀酒工藝流程 參考陳佳昕等[21]發(fā)酵工藝改進:

工藝操作要點:糊化:稱取一定質(zhì)量萌發(fā)苦蕎粉,按1∶5比例加入去離子水,充分震蕩混勻,置于90 ℃水浴鍋中不間斷晃動,糊化30 min;液化:糊化液中按1%加入α-淀粉酶,60 ℃、30 min條件下進行液化;糖化:在一定溫度條件下,液化液中按一定添加量加入β-淀粉酶,糖化一定時間,糖化結(jié)束后于100 ℃中水浴10 min滅酶;酵母活化:取10倍于干酵母量的35 ℃ 2%的糖水復水活化30 min;酒精發(fā)酵:將活化好的酵母菌按接菌量為2.5%接入糖化液中,在28 ℃恒溫恒濕靜置發(fā)酵4 d。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件單因素實驗設計 將浸泡5 h的苦蕎種子分為若干份,每組平行做3份。以總黃酮、總酚酸為指標,考察KCl溶液濃度(5、10、15、20、25 mmol/L)、NaCl溶液濃度(10、20、30、40、50 mmol/L)、培養(yǎng)溫度(15、20、25、30、35 ℃)以及光照時間(2、4、6、8、10 h)對萌發(fā)苦蕎中功能活性物質(zhì)的影響。采用控制變量法,其中初始條件為KCl溶液濃度10 mmol/L、NaCl溶液濃度20 mmol/L、培養(yǎng)溫度15 ℃,每天用15 W白光光照2 h。培養(yǎng)3 d后烘干磨粉測總黃酮、總酚酸含量。

1.2.3.2 糖化條件單因素實驗設計 準確稱取若干份萌發(fā)苦蕎粉,每份3 g放于100 mL錐形瓶中,每組平行做3份。按照1∶5 (g/mL)料液比加入15 mL去離子水,放入90 ℃磁力攪拌器中糊化30 min,30 min后取出并用冷水冷卻至50 ℃,加入1%的α-淀粉酶60 ℃液化30 min,取出冷卻至40 ℃。以DE值為指標,考察糖化酶添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)、糖化溫度(45、50、55、60、65、70 ℃)、糖化時間(0.5、1、2、3、4、5 h)對DE值的影響。采用控制變量法,其中初始條件為糖化酶添加量2.5%、糖化溫度55 ℃、糖化時間3 h,糖化結(jié)束后測定還原糖含量。

1.2.4 Box-Behnken響應面優(yōu)化設計

1.2.4.1 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件的響應面優(yōu)化試驗 以KCl濃度(A)、培養(yǎng)溫度(B)、光照時間(C)三個因素為自變量,總黃酮和總酚酸為響應值設計三因素三水平實驗方案,各因素及水平見表1。

表1 萌發(fā)階段響應面實驗因素及水平表Table 1 Levels and factors of the response surface experiment in germination stage

1.2.4.2 糖化階段的響應面優(yōu)化試驗 以糖化時間(A)、糖化溫度(B)、酶添加量(C)三個因素為自變量,DE值為響應值設計三因素三水平實驗方案,各因素及水平見表2。

表2 糖化階段響應面實驗因素及水平Table 2 Factors and level of the response surface experiment in saccharification stage

1.2.5 指標的測定

1.2.5.1 總黃酮含量測定 參照萬燕等[22]的方法并加以改進測定總黃酮含量。準確稱取20 mg蘆丁標準品,70%乙醇溶液定容至100 mL,得0.2 mg/mL蘆丁母液。從蘆丁母液中分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于20 mL具塞試管中,加入2 mL 0.1 mol/L三氯化鋁、3 mL 1 mol/L醋酸鉀溶液、70%乙醇定容至10 mL,搖勻,靜置30 min后于420 nm處測定吸光度。標準曲線方程y=6.1325x+0.0066(R2=0.9996),其中x為質(zhì)量(mg),y為吸光度值。

準確稱取0.5 g萌發(fā)苦蕎粉,以1∶70比例加入70%乙醇35 mL,在700 W、40 Hz、50 ℃超聲條件下提取20 min,將試樣在4000 r/min 離心10 min,得總黃酮提取液。從總黃酮提取液中取0.5 mL于20 mL具塞試管,參照上述步驟測定吸光度。

式中:Y1為總黃酮含量(mg/g);X1為提取液中總黃酮質(zhì)量(mg);m為萌發(fā)苦蕎粉重量(g);V取為提取液中移取體積;V定為提取液總體積。

1.2.5.2 總酚酸含量測定 參照汪雪嬌等[23]的方法并加以改進測定總酚酸含量。準確稱取25 mg沒食子酸標準品,70%乙醇定容至100 mL,得到0.25 mg/mL沒食子酸母液。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒食子酸母液于20 mL具塞試管中,用70%乙醇補足5 mL,加入1 mL福林酚和3 mL 15%碳酸鈉溶液,用去離子水定容至20 mL,避光顯色1 h,在765 nm處測吸光度。標準曲線方程為y=5.0931x+0.0095(R2=0.999),其中:x為質(zhì)量(mg),y為吸光度值。

發(fā)芽苦蕎粉總酚酸提取液參照1.2.5.1,測定步驟同上。

式中:Y2為總酚酸含量(mg/g);X2為提取液中總酚酸質(zhì)量(mg);m為萌發(fā)苦蕎粉重量(g);V取為提取液中移取體積;V定為提取液總體積。

1.2.5.3 DE值的計算 還原糖的測定參照GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》中的直接滴定法,以堿性酒石酸溶液標定,葡萄糖計。

DE參照馬坤[24]的方法測定。取20 mL酶解液在100 ℃下干燥至恒重,測其總干物質(zhì)含量,還原糖與總干物質(zhì)含量之比為DE值。

1.2.6 酒精度、功能活性物質(zhì)及抗氧化性測定

1.2.6.1 酒精度 采用GB 5009.225-2016《酒中乙醇濃度的測定》密度瓶法進行酒精度測定。

1.2.6.2 GABA含量 采用外標法進行標準曲線的繪制:準確配制0.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL GABA標準溶液,從中各取1 mL標準液于4 mL小離心管中,加入50 μL的鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)衍生液充分振蕩,靜置5 min,用0.22 μm有機濾膜過濾,實驗重復3次。標準曲線方程為:y=22411x+76112(R2=0.9962),所測濃度范圍為0～200 μg/mL,其中:x為濃度(μg/mL),y為峰面積。

根據(jù)郭曉蒙等[25]方法改進,將發(fā)酵結(jié)束后樣品在4000 r/min離心10 min,吸取上清液1 mL置于4 mL小離心管中,50 μL OPA柱前衍生,混勻并靜止5 min,過0.22 μm有機濾膜,待測。參照QB/T 4587-2013洗脫程序,如表3。日本島津,ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相A:0.02 mol/L乙酸鈉;流動相B:乙腈;檢測波長:338 nm;進樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min,柱溫:40 ℃。

表3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution program

1.2.6.3 DPPH自由基清除率 參照盧美歡等[26]的方法加以改進。準確稱取20 mg DPPH,用無水乙醇溶解并定容至250 mL,避光保存,現(xiàn)配現(xiàn)用。將發(fā)酵結(jié)束后的樣品在4000 r/min離心10 min,取2 mL樣品上清液置于20 mL具塞試管中,加入2 mL DPPH溶液,搖勻,黑暗放置30 min,以無水乙醇為空白,用紫外分光光度計于517 nm測其吸光度Ai;取2 mL樣品與2 mL無水乙醇混合均勻黑暗靜置30 min測定吸光度Aj;2 mL DPPH與2 mL無水乙醇混合溶液相同條件下測定吸光度Ac。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

1.2.7 萌發(fā)苦蕎酒理化指標的測定

1.2.7.1 總酸、氨基酸態(tài)氮、pH 參照GB/T 13662-2018。將1.2.2發(fā)酵結(jié)束的樣品在4000 r/min離心10 min,取10 mL上清液于150 mL燒杯中,加入無二氧化碳的水50 mL,置于磁力攪拌器上,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定,直至pH=8.20為滴定終點,記下消耗氫氧化鈉體積(V1)。向溶液中加入甲醛溶液10 mL,繼續(xù)用氫氧化鈉滴定,直至pH=9.20,記下加甲醛后消耗氫氧化鈉體積(V2)。同時做空白實驗,分別記錄不加甲醛及加入甲醛溶液時,空白實驗消耗氫氧化鈉體積(V3、V4)。實驗重復三次,取平均值。取上清液,采用pH計測定pH,實驗重復三次,取平均值。

式中,V0為吸取樣品體積(mL);V1為測定樣品時,消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);V3為空白實驗消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);C1為氫氧化鈉溶液濃度(mol/L);M1為乳酸的摩爾質(zhì)量(g/mol)(M1=90)。

式中,V0為吸取樣品體積(mL);V2為加入甲醛后,測定樣品時消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);V4為加入甲醛后,空白實驗時消耗0.1 mol/L氫氧化鈉溶液體積(mL);C2為氫氧化鈉溶液濃度(mol/L);M2為氮的摩爾質(zhì)量(g/mol)(M2=14)。

1.2.7.2 致病菌檢測 金黃色葡萄球菌參照GB 4789.10-2016;沙門氏菌參照GB 4789.4-2016。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010,Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面實驗設計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件的確定

2.1.1 培養(yǎng)溫度對萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量的影響 由圖1可知,培養(yǎng)溫度在15～35 ℃范圍內(nèi),總黃酮和總酚酸的含量隨溫度的變化趨勢均為先上升后下降。其中,總黃酮含量在20 ℃時達到最大,為13.29 mg/g,總酚酸含量在25 ℃時達到最大,為15.98 mg/g,在適宜溫度條件下,酶活力增加,黃酮、酚酸等次級代謝產(chǎn)物得到富集。溫度超過25 ℃后,兩者的含量下降趨勢明顯,這是因為溫度升高,合成黃酮、酚酸的關(guān)鍵酶-苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)活性下降[27],導致黃酮、酚酸類物質(zhì)含量減少。因此,適宜培養(yǎng)溫度為20 ℃。

圖1 不同培養(yǎng)溫度下萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量

2.1.2 光照時間對萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量的影響 由圖2可知,每天光照時間在2～4 h時,總黃酮、總酚酸含量呈上升趨勢,光照4 h時,兩者含量均達到最大值,其中總黃酮含量為12.56 mg/g,總酚酸含量為14.03 mg/g,有研究表明[28-29],光照能在苦蕎萌發(fā)階段提供能量,合成黃酮類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶-PAL和CHI活性提高,有利于合成次級代謝產(chǎn)物。光照時間在4～10 h時,兩者含量呈下降趨勢,原因可能是黃酮、酚酸類物質(zhì)分解合成其他物質(zhì)[30]。因此,最佳光照時間為4 h。

圖2 不同光照時間下萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量

2.1.3 鹽種類及濃度對萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸含量的影響 由圖3a可知,KCl濃度在5～20 mmol/L時,總黃酮、總酚酸均呈上升趨勢,KCl濃度為20 mmol/L時,兩者含量達到最大值,其中總黃酮含量為13.29 mg/g,總酚酸為16.17 mg/g。KCl濃度在20～25 mmol/L時,兩者均呈下降趨勢,說明適當?shù)柠}脅迫處理,有利于刺激PAL和CHI活性,增加黃酮、酚酸含量[22],當KCl濃度再增加時,細胞內(nèi)外滲透壓加大導致細胞脫水,加劇鹽脅迫傷害,這與劉建新等[31]的研究結(jié)果一致。由圖3b可知,NaCl濃度10～40 mmol/L時,總黃酮和總酚酸含量呈上升趨勢,在NaCl 濃度為40 mmol/L時達到最大,此時總黃酮含量為12.34 mg/g,總酚酸為15.16 mg/g。NaCl濃度40～50 mmol/L時,兩者含量呈下降趨勢。通過對萌發(fā)3 d的苦蕎進行不同種類鹽處理,發(fā)現(xiàn)在同一濃度條件下,經(jīng)KCl脅迫后,萌發(fā)苦蕎中黃酮、酚酸類等物質(zhì)含量高于經(jīng)NaCl脅迫處理,K+、Na+與合成黃酮、酚酸類的關(guān)鍵酶之間的關(guān)系有待進一步研究。因此,最佳鹽種類及濃度為20 mmol/L KCl。

圖3 不同鹽脅迫對萌發(fā)苦蕎中總黃酮、總酚酸的影響

2.2 苦蕎萌發(fā)培養(yǎng)條件響應面試驗結(jié)果

2.2.1 萌發(fā)苦蕎的響應面設計及結(jié)果 采用Design-Expert 8.0.6軟件進行實驗設計,以KCl濃度(A)、溫度(B)、時間(C)為自變量,總黃酮(Y1)、總酚酸(Y2)為指標進行三因素三水平實驗,實驗設計及結(jié)果見表4。

表4 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)的響應面設計與結(jié)果Table 4 Design and results Germination culture conditions of buckwheat by response surface experiment

2.2.2 萌發(fā)苦蕎培養(yǎng)條件回歸方程及響應面實驗方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件對表中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,分別得到各個因素對樣品總黃酮和總酚酸兩個指標的二次回歸方程分別如下:

黃酮含量=14.52-0.28A-0.35B+0.094C-0.43AB+0.5AC-0.69BC-1.32A2-2.14B2-1.75C2

酚酸含量=16.54-0.036A-0.24B+0.47C-0.18AB-0.92AC-0.58BC-0.19A2-2.88B2-2.15C2

表5 總黃酮、總酚酸的響應面實驗方差分析Table 5 Analysis of variance for the response surface experiment of total flavonoids and total phenolic

2.2.3 各因素交互作用分析 由Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面實驗,剔除不顯著項得到圖4。KCl和光照時間交互作用產(chǎn)生的等高線圖為橢圓狀,表明兩者交互作用對總酚酸含量影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。固定KCl與培養(yǎng)溫度,隨著光照時間延長,總酚酸含量呈先上升后下降趨勢,同時得出酚酸含量對光照時間的變化比KCl的變化敏感。

圖4 KCl和光照時間的響應面及等高線圖

2.2.4 最佳萌發(fā)培養(yǎng)條件確定 由Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken響應面設計進行實驗,得出總黃酮、總酚酸的最佳提取條件為:KCl濃度19.5 mmol/L、培養(yǎng)溫度24.68 ℃、光照時間4.17 h,在此條件下預測的總黃酮含量為14.54 mg/g,總酚酸為16.57 mg/g?？紤]到實際情況,將原有的理論模型修改為:20 mmol/L KCl、培養(yǎng)溫度25 ℃、光照時間4 h,在此條件下,總黃酮含量為(14.70±0.08) mg/g,總酚酸含量為(16.78±0.05) mg/g。

2.3 萌發(fā)苦蕎酒糖化工藝的優(yōu)化

2.3.1 糖化溫度對DE值的影響 由圖5可知,糖化溫度在45～60 ℃時,DE值呈上升趨勢,在60 ℃時達到最大,此時DE值為22.36%,說明溫度對于酶活性有重要作用,溫度適宜酶活力升高,在固定時間內(nèi)分解產(chǎn)生更多葡萄糖[21]。糖化溫度在60～70 ℃時,DE值呈下降趨勢,表明溫度升高,破壞酶活性,從而水解淀粉能力下降,DE值降低。因此,最佳糖化溫度為60 ℃。

圖5 糖化溫度對DE值的影響

2.3.2 酶添加量對DE值的影響 由圖6可知,在溫度、酶解時間以及底物濃度固定時,酶添加量在0.5%～2.5%時,隨著酶添加量的增加,DE值呈上升趨勢,并在2.5%添加量時DE值達到最大,為22.51%。酶添加量在2.5%～3%時,酶解效果達到飽和,DE值基本保持不變[31]。因此,最佳酶添加量為2.5%。

圖6 酶添加量對DE值的影響

2.3.3 糖化時間對DE值的影響 由圖7可知,糖化時間在0.5～3 h時,DE值呈上升趨勢,且在2～3 h間上升速率較大,表明此階段是生成還原糖關(guān)鍵時期,糖化時間為3 h時,DE值達到最大為23.56%,表明在溫度、酶添加量以及底物濃度固定時,糖化3 h底物分解徹底,產(chǎn)生的還原糖達到最大程度[32]。糖化時間在3～5 h時,DE值趨于穩(wěn)定,表明苦蕎中淀粉已最大程度分解完成。因此,最佳糖化時間為3 h。

圖7 糖化時間對DE值的影響

2.4 糖化工藝響應面實驗結(jié)果

2.4.1 糖化工藝響應面設計及結(jié)果 采用Design-Expert 8.0.6軟件進行實驗設計,以糖化時間(A)、糖化溫度(B)、酶添加量(C)為自變量,DE值為指標,進行三因素三水平實驗,實驗設計及結(jié)果見表6。

表6 糖化工藝響應面設計與結(jié)果Table 6 The response surface design and results of saccharification process

2.4.2 糖化工藝響應面實驗方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件對表中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,得到各個因素對樣品DE值指標的二次回歸方程分別如下:

DE值=23.58+1.54A-0.25B+0.80C-0.23AB-0.25AC-0.78BC-1.08A2-1.69B2-0.081C2

由表7中可知,模型DE值的p值<0.0001，表明該模型差異顯著。失擬項p=0.4127>0.05,沒有顯著性差異,說明該模型擬合性良好。該模型的決定系數(shù)R2=0.9807>0.8,表明該二次方程能夠較好地擬合真實的響應面。由回歸方程和方差分析可知,模型中A、C、BC、A2、B2對DE值影響極顯著(p<0.01),B、AB、AC、C2對DE值影響不顯著。據(jù)統(tǒng)計學分析,A、B、C三因素所對應的F值越大,說明該因素對DE響應值的影響越大[33]。因此可知影響DE值順序為A>C>B,即糖化時間>酶添加量>糖化溫度。

表7 DE值的響應面實驗方差分析Table 7 Analysis of variance for the response surface experiment of DE

2.4.3 響應面中各因素對DE值的結(jié)果分析 由Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗,剔除不顯著項得到如圖8。糖化溫度和酶添加量交互作用產(chǎn)生的等高線圖為橢圓狀,表明兩者交互作用對DE值影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。固定酶添加量及糖化時間,隨著溫度升高,DE值呈先上升后下降趨勢,這與酶的本質(zhì)相關(guān),同時得出DE值對酶添加量的變化比溫度的變化敏感。

圖8 糖化溫度和酶添加量的響應面及等高線圖

2.4.4 最佳糖化工藝條件確定 由Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken響應面設計進行實驗,得出DE值的最佳糖化條件為:時間3.63 h、糖化溫度58.26 ℃、酶添加量3%,在此條件下預測的DE值為24.89%,考慮到實際情況,將原有的理論模型修改為:糖化時間3.5 h、糖化溫度58 ℃、糖化酶添加量3%,在此條件下,DE值為24.13%±0.02%。

2.5 不同發(fā)酵天數(shù)酒精度、功能活性物質(zhì)及抗氧化性變化

由圖9a可知,萌發(fā)苦蕎酒在發(fā)酵1～4 d時,酒精度呈上升趨勢,并在發(fā)酵第4 d時,酒精度達到最大值,為8.83%±0.11% vol;在4～7 d時,酒精度略有下降。因此,萌發(fā)苦蕎酒發(fā)酵時間為4 d。

圖9 不同發(fā)酵天數(shù)酒精度、功能活性物質(zhì)及抗氧化性變化

由圖9b可知,苦蕎芽發(fā)酵時,總黃酮、總酚酸以及GABA含量處于動態(tài)變化,其中總黃酮含量隨著發(fā)酵天數(shù)延長,呈下降趨勢,在發(fā)酵第4 d時,酒液中總黃酮濃度減少至(1.458±0.015) mg/100 mL,這可能與黃酮極性相關(guān);總酚酸、GABA含量隨著發(fā)酵天數(shù)的變化趨勢基本一致,呈先上升后下降趨勢,并均在發(fā)酵3 d時達到最大值,分別為(33.33±0.02)、(15.74±0.03) mg/100 mL;DPPH自由基清除率在發(fā)酵第3 d時達到最大,為90.15%±0.01%。

萌發(fā)苦蕎經(jīng)過4 d發(fā)酵,在發(fā)酵結(jié)束第4 d時,總黃酮含量為(1.458±0.015) mg/100 mL,總酚酸含量為(24.93±0.01) mg/100 mL,GABA含量為(12.33±0.012) mg/100 mL,DPPH自由基清除率為85.22%±0.01%。

2.6 最優(yōu)條件下萌發(fā)苦蕎酒理化指標

萌發(fā)苦蕎經(jīng)過4 d發(fā)酵后,酒精度約為8.8% vol,pH、總酸(以乳酸計)、氨基酸態(tài)氮結(jié)果均達到清爽型半甜黃酒標準,同時,金黃色葡萄球菌、沙門氏菌未檢出。因此,萌發(fā)苦蕎酒總體符合黃酒(GB/T 13662-2018)的標準。

表8 萌發(fā)苦蕎酒基本理化指標Table 8 Basic physical and chemical indicators of germinated buckwheat wine

3 結(jié)論

通過單因素和響應面試驗,分別對苦蕎萌發(fā)培養(yǎng)條件和萌發(fā)苦蕎酒糖化工藝進行優(yōu)化,確定苦蕎萌發(fā)培養(yǎng)條件為20 mmol/L KCl、培養(yǎng)溫度25 ℃、光照時間4 h,在此萌發(fā)條件下,萌發(fā)苦蕎總黃酮含量為(14.70±0.08) mg/g,總酚酸含量為(16.78±0.05) mg/g;最佳糖化工藝為糖化酶添加量3%、糖化溫度58 ℃、糖化時間3.5 h,在此糖化條件下,DE值為24.13%±0.02%。萌發(fā)苦蕎發(fā)酵4 d后,酒精度為8.83%±0.11% vol,總黃酮含量為(1.458±0.015) mg/100 mL,總酚酸含量為(24.93±0.01) mg/100 mL,GABA含量為(12.33±0.012) mg/100 mL,DPPH自由基清除率為85.22%±0.01%,口感醇厚,是一種較好的低度型萌發(fā)苦蕎酒,為低醇度酒釀造工藝提供一定理論基礎(chǔ)。