孫雪梅,蔣 將,劉元法

(江南大學(xué)食品學(xué)院,食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

油菜籽作為世界上第三大油料作物,在我國每年年產(chǎn)量均居第一。菜籽粕作為油脂加工的副產(chǎn)物,其蛋白含量較高,是一種豐富的植物蛋白資源。且菜籽蛋白具有平衡的氨基酸模式,含硫氨基酸的含量高于大豆蛋白[1]。但目前菜籽粕主要用作動(dòng)物飼料或肥料,而限制菜籽蛋白在人類食品中應(yīng)用的主要原因是存在抗?fàn)I養(yǎng)因子,如植酸、硫苷、芥子酸、酚類物質(zhì)及纖維等[2]。盡管引入了“雙低菜籽”品種,但高含量的多酚和植酸依然是限制菜籽蛋白在食品中應(yīng)用的重要因素[3]。多酚在堿性pH條件下,氧化形成醌類物質(zhì),與蛋白共價(jià)結(jié)合,從而導(dǎo)致蛋白溶液呈現(xiàn)墨綠色[4]。此外,多酚-蛋白復(fù)合物的形成還會(huì)降低菜籽粕的消化率[5]。因此,降低和脫除菜籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)提高菜籽蛋白的應(yīng)用具有重要意義,同時(shí)脫酚后蛋白加工功能性有待進(jìn)一步研究。

研究表明,通過一定的加工技術(shù)降低抗?fàn)I養(yǎng)因子水平,可顯著提高雙低菜籽粕及其蛋白質(zhì)在動(dòng)物飼料中的消化率。其中,多酚對(duì)菜籽粕及蛋白的消化性質(zhì)也起到重要作用。Qiao等[6]研究發(fā)現(xiàn)盡管菜籽中芥子酸對(duì)肉食雞沒有明顯的毒性,但高含量下會(huì)影響氨基酸的消化率。Serraino等[7]的研究結(jié)果表明菜籽中酚酸的脫除能夠增加氨基酸的釋放速率。一方面,多酚可通過氫鍵、疏水相互作用及共價(jià)結(jié)合方式與蛋白形成復(fù)合體,從而降低蛋白的營養(yǎng)價(jià)值;另一方面,單寧也會(huì)阻礙消化酶的作用,影響蛋白水解[8]。

pH偏移作為一種有效的蛋白改性方法,通過將蛋白在強(qiáng)堿條件下維持一段時(shí)間后再將其調(diào)至中性,從而誘導(dǎo)球體蛋白進(jìn)入“熔球態(tài)”,即蛋白質(zhì)保持相對(duì)緊湊的結(jié)構(gòu)(即保留大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu))但往往會(huì)失去一些三級(jí)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)。處于“熔球態(tài)”中的蛋白,其溶解度、乳化性及抗氧化性質(zhì)能夠得到明顯改善[9]。

本文采用體外模擬胃腸消化模型,通過水解度、蛋白電泳及微觀結(jié)構(gòu)等來研究脫酚及pH偏移處理對(duì)菜籽蛋白及蛋白乳液體系消化性的影響,從而為菜籽蛋白在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘藍(lán)型雙低脫皮油菜籽 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所;大豆油 無錫歐尚超市;胃蛋白酶(3000 U/mg)、胰蛋白酶(2500 U/mg)、脂肪酶(100～500 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇、正己烷等試劑 均為分析純。

5804R離心機(jī) 德國Eppendorf公司;FE28 pH計(jì) 梅特勒公司;Nano Brook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀 美國布魯克海文儀器公司;DM2700P偏光顯微鏡 德國徠卡公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酚類化合物的脫除 將脫皮菜籽粉碎后,過80目篩,用正己烷-乙醇(10∶1,v/v)混合溶劑脫脂。根據(jù)Vuorela等[10]的方法對(duì)脫脂菜籽粉進(jìn)行脫酚處理,略作修改。稱取一定量的脫脂菜籽粕,以物料比1∶10 (w/v)加入有機(jī)試劑提取酚類化合物,鑒于食品安全要求,用70%乙醇(Et)室溫下攪拌1 h,真空抽濾,將抽濾后的菜籽粕置于通風(fēng)櫥過夜,待提取蛋白。

1.2.2 菜籽分離蛋白的制備 根據(jù)Pirestani等[11]的方法提取菜籽分離蛋白,并作適當(dāng)修改。稱取一定量的脫酚菜籽粉,分散于去離子水中,料水比為1∶10 (w/v),用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至11.0,室溫?cái)嚢? h后在8000×g,4 ℃離心30 min。用2 mol/L的HCl將上清液調(diào)至pH4.5,靜置30 min,5000×g 離心20 min。將沉淀水洗3次,調(diào)節(jié)pH至7.0,冷凍干燥,得到蛋白Et,未脫酚處理提取的蛋白為C。參照GB 5009.5-2016,采用凱式定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 pH偏移處理 參照J(rèn)iang等[9]的方法,配制濃度為20 mg/mL的菜籽分離蛋白溶液。用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至12.0,室溫下攪拌1 h,隨后用2 mol/L HCl再將其調(diào)回pH7.0,攪拌1 h。由C和Et處理后分別得到C12、Et12。對(duì)照組加入相應(yīng)摩爾量的NaCl溶液。

1.2.4 蛋白體外模擬消化 參照Kaur等[12]的方法,將脫酚及pH偏移處理的蛋白溶液(6 mg/mL)用1 mol/L HCl調(diào)至pH2.0,加入胃蛋白酶(酶/底物1∶20,溶于0.1 mol/L HCl),在37 ℃恒溫?cái)嚢? h。反應(yīng)結(jié)束后,立即用0.9 mol/L NaHCO3將蛋白水解產(chǎn)物調(diào)至pH5.3,隨后用1 mol/L NaOH繼續(xù)調(diào)節(jié)pH至7.0,加入胰蛋白酶(酶∶底物=1∶20,溶于磷酸鹽緩沖溶液),在37 ℃恒溫反應(yīng)1 h。蛋白水解期間,分別收集0、30、60、90及120 min的蛋白水解樣品,沸水浴5 min滅酶。將樣品置于-18 ℃保存用于進(jìn)一步分析。

1.2.4.1 水解度測(cè)定 采用OPA(鄰苯二甲醛)法[13]測(cè)定蛋白水解度。將7.620 g硼砂和200 mg十二烷基硫酸鈉(SDS)溶于150 mL去離子水中,使其完全溶解。稱取160 mg OPA試劑溶于4 mL無水乙醇,并轉(zhuǎn)移到上述溶液。將176 mg 1,4-二巰基蘇糖醇(DTT)加入到上述溶液中,定容至200 mL。配制0.1 mg/mL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品,取400 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)水解樣品分別與3 mL OPA試劑混勻,以去離子水作空白,準(zhǔn)確反應(yīng)2 min,在340 nm處測(cè)定吸光值。

其中:OD:吸光值;X:樣品重量(g);P:樣品中蛋白含量(%);0.9516:絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中的絲氨酸-NH2(meqv/L,毫當(dāng)量每升);0.1:樣品體積轉(zhuǎn)換為L,由凱式定氮法測(cè)得。

其中:α=1.00,β=0.40。

其中:h0:水解反應(yīng)前樣品相對(duì)原始底物的水解度值;h1:水解反應(yīng)后樣品相對(duì)原始底物的水解度值;htot=7.8。

1.2.4.2 消化率測(cè)定 通過測(cè)定水解產(chǎn)物的可溶性蛋白濃度表征蛋白消化率。取1 mL水解產(chǎn)物與1 mL三氯乙酸(TCA)溶液(20%,w/v)混合,10000×g離心10 min,收集上清液,并用10% TCA溶液適當(dāng)稀釋,于280 nm處測(cè)定吸光值,使樣品吸光值在保持在標(biāo)曲范圍內(nèi)。以牛血清蛋白做標(biāo)曲,得線性回歸方程為:

y=0.5869x+0.0008,R2=0.9994。

其中:y為吸光值,x為標(biāo)品濃度(mg/mL)。

根據(jù)線性回歸分析上清液中可溶性蛋白濃度。

其中:C:樣品蛋白濃度(mg/mL);OD樣品:水解后的上清液樣品吸光值;0.5869,0.0008:由牛血清標(biāo)曲所得的參數(shù);n:樣品稀釋倍數(shù)。

1.2.4.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)Sch?gger等[14]的方法稍作修改,制備聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠與分離膠濃度分別為4%和16%(w/v)。將水解樣品溶解于上樣緩沖液(25 mL 0.5 mol/L Tris,20 mL甘油,40 mL 10% SDS,15 mL水,pH6.8),使蛋白最終濃度為2 mg/mL,上樣量為15 μL。電泳在恒定電壓下進(jìn)行:初始電壓30 V,進(jìn)入分離膠時(shí)電壓為100 V。

1.2.4.4 ABTS+·清除率 參照Ma等[15]的方法測(cè)定ABTS+·清除率。將7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液和2.45 mmol/L高硫酸鉀(最終濃度)混合,在室溫、避光條件下靜置12～16 h,形成ABTS自由基工作液。將工作液用0.2 mol/L PBS(pH7.4)稀釋,使其在734 nm處的吸光度值為0.70±0.02。取20 μL蛋白水解樣品與1980 μL工作液混合反應(yīng)10 min,在734 nm處測(cè)定吸光值。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為:

y=0.3844x+0.001,R2=0.9971。

其中:y為吸光值,x為標(biāo)品濃度(mmol/L)。

根據(jù)線性回歸分析,結(jié)果以Trolox當(dāng)量(mmol/L)表示。

1.2.4.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定 基于Zhou等[16]描述的方法。將1.5 mL的蛋白水解樣品與等體積0.1 mmol/L DPPH溶液混合。振蕩搖勻并在室溫下反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光度。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為:

y=0.0233x+0.0216,R2=0.9985。

其中:y為吸光值,x為標(biāo)品濃度(μmol/L)。

根據(jù)線性回歸分析,結(jié)果以Trolox當(dāng)量(μmol/L)表示。

1.2.5 蛋白乳液制備 將菜籽分離蛋白配制成濃度為10 mg/mL的蛋白溶液,與大豆油以1∶3 (v/v)的比例混合,用Ultra-Turrax高速分散機(jī)在13500 r/min的剪切速率下剪切2 min進(jìn)行預(yù)乳化。然后將乳狀液用AH-2010高壓均質(zhì)機(jī)在30 MPa壓力下均質(zhì)3次。

1.2.6 乳化性質(zhì)的測(cè)定 將1.2.5中剪切過的預(yù)乳液迅速倒入25 mL小燒杯中,立即從距燒杯底部5 mm處取20 μL乳狀液于試管中,在試管中加入5 mL 0.1%(w/v)SDS溶液,混勻后于500 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)0;靜置30 min重新取樣測(cè)定吸光度值A(chǔ)30,以0.1% SDS溶液做空白對(duì)照。

其中:N:稀釋倍數(shù);C:乳化液形成前蛋白溶液中蛋白質(zhì)濃度(g/mL);φ:乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)(L/L);A0:0 min時(shí)乳液的吸光值;A30:30 min時(shí)乳液吸光值。

1.2.7 乳液模擬體外消化 乳液體外模擬消化參照Xu等[17]的方法略作修改。將40 mL乳液與等體積的模擬胃液(胃蛋白酶3.2 g,NaCl 2 g,HCl 7 mL,定容至1 L)混合,再用1.0 mol/L HCl溶液調(diào)至pH2.0,37 ℃恒溫?cái)嚢? h,隨后用2 mol/L NaOH調(diào)至pH7.0,終止反應(yīng)。取出40 g水解產(chǎn)物,加入10 g模擬小腸液(脂肪酶1.6 mg/g,胰蛋白酶1.0 mg/g,膽鹽10 mg/g,均為最終濃度),在37 ℃條件下繼續(xù)攪拌1 h。反應(yīng)結(jié)束后,沸水浴5 min滅酶。

1.2.7.1 微觀結(jié)構(gòu) 將乳液用去離子水稀釋5倍,混勻,取一滴樣品置于載玻片上,緩慢放置蓋玻片,避免起泡,用DM2700P偏光顯微鏡的普通光學(xué)模式(物鏡20×,目鏡10×)下觀察乳液油滴分布及聚集情況。

1.2.7.2 粒徑測(cè)定 將乳液用去離子水稀釋500倍,采用多角度粒度分析儀測(cè)定乳液粒徑,分散相折射率為1.330,分散質(zhì)折射率為1.492,測(cè)定溫度為25 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)2～3次,并且至少3次平行,結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”形式。顯著性分析采用SPSS 21.0通過Duncan法進(jìn)行評(píng)估(p<0.05)。圖表由Origin 8.0軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫酚及pH偏移對(duì)蛋白體外消化的影響

2.1.1 水解度 蛋白水解度的變化通常用來解釋蛋白消化率。脫酚及pH偏移處理的菜籽蛋白經(jīng)過體外模擬胃腸消化后,消化產(chǎn)物的水解度變化如表1。隨消化時(shí)間的延長,所有樣品的蛋白水解度呈上升趨勢(shì)。經(jīng)過60 min胃蛋白酶水解后,C和C12的水解度相較于脫酚處理的樣品(Et及Et12)分別提高了39.2%和68.4%,這表明蛋白經(jīng)過脫酚處理后抑制了蛋白在胃消化階段的水解。然而經(jīng)過1 h(60～120 min)胰蛋白酶水解后,脫酚處理的樣品(Et、Et12)水解度相較于空白(C、C12)分別增加了17.1%和22.9%，表明酚的脫除促進(jìn)了蛋白在小腸階段的水解。

可能的原因是脫酚處理促進(jìn)了蛋白結(jié)構(gòu)的展開,進(jìn)一步誘導(dǎo)疏水聚集,掩蓋了胃蛋白酶與蛋白的結(jié)合位點(diǎn),從而使脫酚蛋白在胃蛋白酶消化階段的水解較緩慢[18]。經(jīng)過1 h的胃消化,誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)一定程度上被破壞。與空白相比,前期脫酚處理和pH偏移處理均使得蛋白結(jié)構(gòu)更加松散,因此更有助于胰蛋白酶的消化?？偟膩碚f,菜籽蛋白中內(nèi)源酚的存在會(huì)降低蛋白的消化率。此外,單純的pH偏移處理對(duì)蛋白消化率無顯著影響(p>0.05),但pH偏移處理結(jié)合脫酚處理可大大增加蛋白的消化率。

2.1.2 體外消化率 不同消化時(shí)間的蛋白消化產(chǎn)物通過TCA沉淀,其上清液中可溶性蛋白的濃度變化如圖1。蛋白的原始濃度為6 mg/mL,未經(jīng)蛋白酶消化前,TCA沉淀后的上清液蛋白濃度約為0.7 mg/mL,胃蛋白酶水解后,上清液中可溶性蛋白濃度顯著增大到5 mg/mL左右。胃蛋白酶水解過程中(30～60 min),所有脫酚樣品(Et和Et12)的可溶性蛋白濃度均低于其對(duì)應(yīng)的空白樣品，與水解度變化相同。僅pH偏移處理的樣品(C12)與空白沒有差異。即脫酚處理誘導(dǎo)的蛋白可溶性聚集阻礙了胃蛋白酶的水解,pH偏移處理對(duì)胃蛋白酶的水解無顯著影響。而經(jīng)過1 h的胰蛋白酶水解后,可溶性聚集被破壞,脫酚處理及胃蛋白酶的水解均促進(jìn)了蛋白結(jié)構(gòu)的展開,Et的可溶性蛋白濃度顯著提高(p<0.05),比對(duì)照組提高了22.3%,這與蛋白水解度的變化趨勢(shì)一致。同樣的,pH偏移在胰蛋白酶水解階段影響較小。

圖1 脫酚及pH偏移處理對(duì)CPI體外模擬消化產(chǎn)物可溶性蛋白濃度的影響

2.1.3 SDS-PAGE 為了進(jìn)一步考察體外模擬消化時(shí)蛋白酶對(duì)不同方式處理的蛋白亞基組成的影響,進(jìn)行非還原SDS-PAGE分析(圖2)。菜籽蛋白主要由12S(α和(亞基)和2S亞基組成,且2S(16 kDa)與12S(49 kDa)均由二硫鍵連接[19]。對(duì)于未經(jīng)消化的天然CPI,脫酚處理可能會(huì)暴露更多的含硫氨基酸并促進(jìn)二硫鍵的形成,因此,在電泳中表現(xiàn)出16 kDa條帶的強(qiáng)度增加。經(jīng)過胃蛋白酶水解后,所有亞基含量均減少,且在10 kDa處生成新的亞基。其中12S中(亞基在未脫酚組CPI(C和C12)明顯減少,在脫酚組(Et和Et12)完全消失。經(jīng)過胰蛋白酶消化,10 kDa亞基條帶,未脫酚組濃度明顯降低,脫酚組消失。與C相比,C12中2S和12S亞基含量均減少。但對(duì)于脫酚后樣品,pH偏移處理對(duì)消化性無明顯影響?？偟膩碚f,脫酚處理對(duì)蛋白消化性變化起到主導(dǎo)作用。這說明脫酚后蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度展開,且原有的酚與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)暴露出來,更有利于其與蛋白酶的結(jié)合。Duodu等[18]曾報(bào)道酚與蛋白結(jié)合形成復(fù)合物,并且酚類物質(zhì)也具有一定的空間位阻效應(yīng),這都會(huì)阻礙酶對(duì)蛋白的作用。但脫酚結(jié)合pH偏移處理后蛋白展開程度較脫酚處理明顯增大,且大量的疏水基團(tuán)暴露誘導(dǎo)蛋白發(fā)生可溶性聚集[9],因此蛋白水解度顯著增大(表1),但電泳結(jié)果沒有顯現(xiàn)出來,有可能是水解成較小分子量的肽,無法在電泳中顯示。

圖2 脫酚及pH偏移處理對(duì)CPI體外模擬消化產(chǎn)物SDS-PAGE的影響

2.1.4 消化產(chǎn)物抗氧化性質(zhì) 酚類物質(zhì)一般具有較好的抗氧化性。蛋白自身也具有一定的抗氧化性,pH偏移處理后的蛋白由于結(jié)構(gòu)展開,疏水基團(tuán)暴露,抗氧化性明顯增大[20]。脫酚及pH偏移處理后的蛋白體外消化產(chǎn)物的ABTS+·及DPPH自由基清除能力如圖3所示。在整個(gè)消化過程中,ABTS+·及DPPH自由基清除能力均呈先增加后降低的趨勢(shì),且在胃蛋白酶水解60 min后達(dá)到最大值。類似的結(jié)果也曾被Zhou等[16]和Phongthai等[21]報(bào)道過。在圖3A中,脫酚處理使得Et蛋白的ABTS+·清除能力降低了69.9%,然而pH偏移處理后的C12提高了172%,脫酚后的樣品再經(jīng)pH偏移處理,其抗氧化性大大增強(qiáng)(80.6%)，這表明蛋白中酚的存在具有重要的抗氧化活性。同時(shí),pH偏移促進(jìn)了蛋白結(jié)構(gòu)的部分展開,暴露了更多的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)及肽,提高了蛋白的自由基清除能力,彌補(bǔ)了脫酚后抗氧化性降低的缺陷。Jiang等[20]在豌豆蛋白中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。經(jīng)過胃蛋白酶水解,消化產(chǎn)物的自由基清除能力均明顯提高,其中C和C12,Et和Et12的ABTS+·及DPPH自由基清除能力分別相互接近,主要是由于胃蛋白酶的水解作用導(dǎo)致蛋白的水解及多肽的產(chǎn)生,使得大量的疏水氨基酸暴露出來。此外,在酸性條件下胃蛋白酶的水解導(dǎo)致一些結(jié)合酚的釋放,增加了自由基清除能力[22]。經(jīng)過1 h的胰蛋白酶的水解后,不同方式處理的蛋白消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力降低了32%～62%,主要原因是胰蛋白酶選擇性地切割堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸),消化產(chǎn)物極性增加使得與自由基反應(yīng)更加困難[23]。

圖3 脫酚及pH偏移處理對(duì)CPI體外模擬消化產(chǎn)物ABTS+·(A)和DPPH·(B)清除率的影響

2.2 模擬乳液體外消化

模擬乳液體外消化條件下的微觀結(jié)構(gòu)和粒徑分布如圖4和圖5所示。圖4表明,菜籽蛋白經(jīng)過pH偏移后,乳化活性及乳化穩(wěn)定性均有很大提高,因此選擇以pH偏移處理后的蛋白為乳化劑來研究脫酚處理對(duì)乳液體外消化性質(zhì)的影響。采用光學(xué)顯微鏡表征乳液在模擬體外消化過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化(如圖5)。在胃消化階段所有乳液樣品均處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，經(jīng)過30 min胃蛋白酶水解后,乳液聚集現(xiàn)象明顯,出現(xiàn)乳液分層現(xiàn)象,被水解蛋白進(jìn)入清液層,上層乳液中的蛋白是由部分水解蛋白和未水解蛋白組成。一方面,在pH2的胃蛋白酶消化過程中,蛋白表面所帶電荷較pH7.5少,斥力減少,從而引起油滴聚集[24];另一方面,胃蛋白酶對(duì)油滴表面吸附的蛋白進(jìn)行了水解,其作用位點(diǎn)是蛋白芳香族氨基酸和一些疏水殘基[24],經(jīng)過1 h胃蛋白酶消化,蛋白的三級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)已被基本破壞,蛋白的乳化能力降低從而誘導(dǎo)油滴聚集[25]。而Et12穩(wěn)定的乳液液滴聚集程度較C12大,這是由于脫酚后蛋白結(jié)構(gòu)較松散有助于蛋白酶的結(jié)合并發(fā)生水解,從而誘導(dǎo)乳液部分聚集。胃蛋白酶水解60 min后,乳液液滴變小,且分散較均勻,可能是由于隨著水解時(shí)間的延長,大量多肽的形成,蛋白表面帶電量增大,油滴的靜電斥力增強(qiáng)。在小腸消化階段,經(jīng)過30 min的脂肪酶及胰蛋白酶的水解后,乳液呈現(xiàn)失穩(wěn)現(xiàn)象,出現(xiàn)明顯的浮油層。從顯微鏡結(jié)果觀察,乳液相油滴分散更加均勻。在此階段,由于膽鹽的加入以及脂肪酶水解產(chǎn)生的游離脂肪酸會(huì)競爭性地取代油滴表面的蛋白[26],從而形成新的較穩(wěn)定的乳液。脫酚處理后的蛋白乳液經(jīng)過1 h的模擬小腸消化,油滴比對(duì)照組小。綜合以上現(xiàn)象表明,蛋白經(jīng)過脫酚處理后能夠提高蛋白乳液的消化率。

圖4 脫酚和pH偏移處理的CPI乳液的乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)

圖5 CPI乳液體外模擬消化產(chǎn)物的微觀結(jié)構(gòu)圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證乳液在消化過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化,對(duì)消化過程中乳液平均粒徑進(jìn)行測(cè)定(圖6)。在胃蛋白酶水解30 min后,C12和Et12穩(wěn)定的乳液平均粒徑明顯增大,分別增大了2.8和3.6倍,表明胃蛋白酶對(duì)界面蛋白的水解促進(jìn)了液滴聚集,尤其是脫酚處理的蛋白乳液。60 min后,乳液粒徑降至2.5～3.5 μm之間。經(jīng)過1 h的胰蛋白酶及脂肪酶的水解后,C12穩(wěn)定的乳液粒徑相比在90 min時(shí)明顯增大,且大于Et12穩(wěn)定的乳液平均粒徑,與圖5中的乳液微觀結(jié)構(gòu)趨勢(shì)一致。

圖6 脫酚處理對(duì)CPI乳液體外模擬消化產(chǎn)物的平均粒徑的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)脫酚處理及pH偏移改性的蛋白,及蛋白穩(wěn)定的乳液來研究不同體系的體外消化。在模擬蛋白消化過程中,水解度及可溶性蛋白濃度變化的結(jié)果表明脫酚處理能顯著提高蛋白的消化率,且脫酚處理結(jié)合pH偏移處理可最大程度提高蛋白體外消化率。SDS-PAGE的結(jié)果中小分子量條帶的消失也證明了脫酚的效果。pH偏移對(duì)蛋白及消化產(chǎn)物的自由基清除能力有明顯提高,并能改善由脫酚導(dǎo)致的較差的自由基清除能力,有望延長蛋白的保質(zhì)期。乳液消化的研究結(jié)果表明,脫酚處理能促進(jìn)乳液中蛋白的水解并降低油滴尺寸。因此,脫酚結(jié)合pH偏移處理可以為菜籽蛋白在人類食品中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。