楊冰鑫,劉曉麗

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣東廣州 510006)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)屬大戟葉下珠屬,源于緬甸和印度,現(xiàn)在中南半島、印度尼西亞、菲律賓、中國(guó)等地均有分布,其中在中國(guó)的產(chǎn)量相對(duì)較多[1]。余甘子已被列為我國(guó)藥食同源品種之一,其果實(shí)含有多酚[2]、超氧化物歧化酶(SOD)、多糖、萜類(lèi)化合物、脂肪酸、蛋白質(zhì)、生物堿,以及12種維生素、17種氨基酸、16種微量元素等成分。余甘子藥理作用也極其廣泛,主要有抗氧化、保肝作用[3-5]、降低血脂作用、抗腫瘤等功效[6]。

近年來(lái),大量文獻(xiàn)報(bào)道,很多植物中提取的酚類(lèi)物質(zhì)具有很好的抗氧化活性。植物酚類(lèi)物質(zhì)被應(yīng)用于多種食品的抗氧化,如肉與肉制品、奶制品、焙烤食品等。據(jù)報(bào)道,余甘子多酚可以作為抗氧化劑替代品運(yùn)用于食品的抗氧化;將余甘子多酚作為一種天然油脂抗氧化劑應(yīng)用于餅干的加工;添加余甘子多酚的產(chǎn)品在貯存過(guò)程中的過(guò)氧化物值和酸價(jià)都明顯低于添加人工合成抗氧化劑BHA的產(chǎn)品等[7]。

本研究主要以溶劑浸提的方法提取余甘子多酚,以期得到余甘子多酚提取的最優(yōu)方案,并對(duì)余甘子多酚的抗氧化活性進(jìn)行研究,為余甘子在天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子鮮果 購(gòu)自四川;昆明小鼠 健康狀況良好,14只,雌雄各半,8～9周齡,25～30 g,許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0034,廣州中醫(yī)藥大學(xué);無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸(TCA)、無(wú)水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、30%雙氧水、水楊酸 分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):149-91-7) HPLC≥98%,上海源葉生物科技有限公司;2-硫帶巴比妥酸(TBA)、福林酚溶液 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 分析純,上海源葉生物科技有限公司;茶多酚 分析純,合肥巴斯夫生物科技有限公司;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、硫酸亞鐵 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑;實(shí)驗(yàn)用水 去離子水。

202-00A烘箱 上海索普儀器有限公司;800T搖擺式高速粉碎機(jī) 廣州市打樣電子機(jī)器設(shè)備有限公司;U-1950紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SHA-BA恒溫振蕩器 常州奧華儀器有限公司;SHZ-(Ⅲ)真空抽濾機(jī) 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精確稱(chēng)量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0050 g,加入濃度為60%的乙醇溶液定容至50 mL,制成沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mL溶液于10 mL的容量瓶中[8],加入5 mL濃度為10%的福林酚溶液,搖勻后靜置5 min,最后加入4.5 mL的7.5%的碳酸鈉溶液定容至刻度線(xiàn),靜置反應(yīng)1 h,用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)在740 nm[9]處測(cè)量各個(gè)樣品的吸光值,以沒(méi)食子酸的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo)制出沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[10]。

1.2.2 余甘子多酚的提取 新鮮余甘子去除果核,55 ℃烘26 h,用搖擺式高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,過(guò)60目篩網(wǎng)既得余甘子粉末[11]。精確稱(chēng)量1 g余甘子粉末,量取25 mL濃度為60%的乙醇溶液于三角瓶中,在溫度為50 ℃的恒溫振蕩器中回旋振蕩135 min,真空抽濾取上清液,濾渣重復(fù)上述操作,合并兩次濾液[12],即得到余甘子多酚提取液。

1.2.3 余甘子多酚含量的測(cè)定 采用福林酚比色法[13],以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)。取0.1 mL濃度為2 mg/mL余甘子提取液于10 mL的定量瓶中,按照1.2.1的方法測(cè)定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總多酚含量,總多酚含量用mg GAE(沒(méi)食子酸)/mg果粉表示,計(jì)算公式如下:

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

總多酚含量(mg GAE/mg)=AV/m

式中,A-沒(méi)食子酸濃度(mg/mL);V-定容后體積(mL);m-樣品質(zhì)量(mg)[14]。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 浸提時(shí)間對(duì)多酚提取效果的影響 余甘子粉末溶于濃度為60%的乙醇,溫度設(shè)置為50 ℃,提取時(shí)間分別為45、90、135、180、225 min,冷卻并進(jìn)行真空抽濾,剩余的濾渣重復(fù)上述操作,合并兩次濾液,得到余甘子多酚提取液,測(cè)定其多酚含量。

1.2.4.2 浸提溫度對(duì)多酚提取效果的影響 余甘子粉末溶于濃度為60%的乙醇,溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70 ℃,135 min后冷卻并進(jìn)行真空抽濾,剩余的濾渣重復(fù)上述操作,合并兩次濾液,得到余甘子多酚提取液,測(cè)定其多酚含量。

1.2.4.3 乙醇濃度對(duì)多酚提取效果的影響 余甘子粉末分別溶于濃度依次為15%、30%、45%、60%、75%的乙醇,溫度設(shè)置為60 ℃,135 min后冷卻并進(jìn)行真空抽濾,剩余的濾渣重復(fù)上述操作,合并兩次濾液,得到余甘子多酚提取液,測(cè)定其多酚含量。

1.2.5 正交試驗(yàn) 本研究采用了三因素三水平的正交試驗(yàn),考查浸提時(shí)間、浸提溫度、乙醇濃度三個(gè)因素對(duì)余甘子多酚提取效果的影響,篩選出最適的提取條件。正交試驗(yàn)因素水平表如下:

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.6 抗氧化性研究

1.2.6.1 總還原能力的測(cè)定 采用鐵氰化鉀還原法[15]測(cè)定。取2.5 mL的pH6.6磷酸緩沖溶液,加入1 mL濃度依次為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液,振蕩混勻,在50 ℃的水浴鍋中放置20 min,取出冷卻至室溫,再加入2.5 mL的10% TCA溶液終止反應(yīng),4000 r/min離心10 min,取2.5 mL的上清液于試管中,加入2.5 mL的去離子水和0.5 mL的0.1% FeCl3溶液振蕩混勻后靜止10 min,在波長(zhǎng)為700 nm處檢測(cè)其吸光度A值,平行3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 采用DPPH清除自由基的方法[16],取3 mL的0.1 mg/mL DPPH-無(wú)水乙醇溶液,加入3 mL濃度依次為6、20、34、48、62 μg/mL的樣品,靜置30 min,4000 r/min離心10 min,最后在517 nm處測(cè)其吸光值為A1,以3 mL的樣品和3 mL的無(wú)水乙醇在517 nm處測(cè)的吸光值為A2,以3 mL的無(wú)水乙醇和3 mL的DPPH-無(wú)水乙醇在517 nm處測(cè)得的吸光值為A3,DPPH自由基清除率的計(jì)算公式為:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)]×100/A3

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為樣品加無(wú)水乙醇的吸光度;A3為無(wú)水乙醇加DPPH上清液的吸光度。

1.2.6.3 羥自由基清除率的測(cè)定 采用水楊酸滴定法[17],利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH,加入水楊酸可以與·OH反應(yīng)并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在510 nm處有吸收峰。先向試管中加入9 mmoL/L FeSO4和1 mL的9 mmoL/L的水楊酸溶液各1 mL,濃度依次為0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg/mL的樣品2 mL,最后加入1 mL的8.8 mmoL/L H2O2進(jìn)行顯色反應(yīng),在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min,最后在510 nm處測(cè)其吸光值為A1,以不加樣品,用45%乙醇溶液代替樣品在510 nm處測(cè)得的吸光值為A3;以用去離子水代替8.8 mmoL/L的H2O2在510 nm處測(cè)得的吸光值為A2,羥自由基(·OH)清除率的測(cè)定公式如下:

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)]×100/A3

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為不加H2O2時(shí)的吸光度;A3為空白上清液的吸光度。

1.2.6.4 自發(fā)性肝脂質(zhì)氧化的抑制實(shí)驗(yàn) 昆明小鼠,處理前禁食禁水12 h,脫臼處死,取其肝臟,用組織搗碎機(jī)搗碎,將搗碎后的肝組織和濃度為0.9%的冰生理鹽水混合,4000 r/min離心4 min,將沉淀進(jìn)行再次研磨,然后混勻制成5%(m/v)的肝勻漿。采用硫帶巴比妥酸顯色法[18-19]進(jìn)行檢測(cè),取5%肝勻漿1 mL,濃度依次為10、40、70、100、130 μg/mL的樣品0.32 mL,在37 ℃的水浴鍋中水浴1.5 h,回旋的轉(zhuǎn)速為180 r/min,加入1 mL的EDTA和TCA的混合液(EDTA的濃度為0.1%,TCA的濃度為10%),4000 r/min離心10 min,再加入1 mL的0.67%TBA,沸水浴30 min,在532 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)2,以加去離子水為空白對(duì)照,測(cè)得吸光值為A1,肝脂質(zhì)氧化抑制率的計(jì)算公式為:

自發(fā)性肝脂質(zhì)氧化抑制率(%)=[1-(A1-A2)]×100/A2

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為空白上清液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

結(jié)果顯示沒(méi)食子酸的濃度在1～5 mg/mL范圍內(nèi),線(xiàn)性回歸方程為:y=0.1431x+0.0791,其中r=0.9997,線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 浸提時(shí)間對(duì)多酚提取效果的影響 從圖2可以看出,當(dāng)浸提時(shí)間在45～135 min范圍內(nèi),隨著時(shí)間的增加,所提取的多酚含量逐漸增加,當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)135 min時(shí),隨著時(shí)間的增加,所提取的多酚含量先急劇減少然后無(wú)明顯變化,可能與余甘子多酚的穩(wěn)定性差有關(guān),當(dāng)浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),其發(fā)生氧化變形的可能性增加,多酚含量出現(xiàn)下降。由圖2可知,最適的浸提時(shí)間為135 min,此時(shí)多酚的含量為(0.1920±0.002) mg GAE/mg。

圖2 不同浸提時(shí)間下多酚的提取效果

2.2.2 浸提溫度對(duì)多酚提取效果的影響 從圖3可以看出,當(dāng)浸提溫度為30～50 ℃時(shí),各提取液中多酚含量無(wú)明顯差異,當(dāng)溫度在60 ℃時(shí)浸提液中總多酚含量達(dá)到最高值,此時(shí)多酚的含量為(0.2036±0.002) mg GAE/mg。當(dāng)浸提溫度超過(guò)60 ℃時(shí),高溫會(huì)導(dǎo)致余甘子多酚部分降解變性,使得余甘子多酚含量降低。因此,浸提的最佳溫度是60 ℃。

圖3 不同浸提溫度下多酚的提取效果

2.2.3 乙醇濃度對(duì)多酚提取效果的影響 從圖4可以看出,當(dāng)乙醇的濃度范圍在15%～45%時(shí),余甘子多酚隨乙醇濃度增加而逐級(jí)遞增,當(dāng)乙醇的濃度為45%時(shí),此時(shí)的所提取出的多酚含量最多為(0.2328±0.003) mg GAE/mg,當(dāng)乙醇的濃度范圍在45%～75%時(shí),所提取的多酚含量呈明顯下降趨勢(shì),這與多酚的性質(zhì)有關(guān),多酚在乙醇中的溶解度相對(duì)于水較好,但當(dāng)乙醇濃度較高時(shí),會(huì)使細(xì)胞蛋白質(zhì)凝固,影響其有效成分的釋放[20]。因此,浸提溶劑最佳濃度為45%。

圖4 不同乙醇濃度下提取多酚的提取效果

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

浸提時(shí)間、浸提溫度以及乙醇濃度對(duì)余甘子多酚的提取工藝存在一定的影響。從表2可以看出最優(yōu)的組合是A2B3C2,此時(shí)浸提時(shí)間為135 min,浸提溫度為70 ℃,乙醇的濃度為45%，所提取的多酚含量為(0.2427±0.008) mg GAE/mg。通過(guò)方差分析可知,浸提時(shí)間、浸提溫度、不同乙醇濃度對(duì)余甘子多酚提取的影響極顯著;這三個(gè)因素對(duì)余甘子多酚提取含量的影響大小依次為:浸提溫度>乙醇濃度>浸提時(shí)間。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.4 抗氧化性研究

2.4.1 總還原能力的測(cè)定 總還原能力可以解釋物質(zhì)抗氧化活性的原理,作為抗氧化能力評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一[21],余甘子多酚類(lèi)物質(zhì)中的酚羥基將K3[Fe(CN)6]中的Fe3+還原成Fe2+,亞鐵氰化鉀和三氯化鐵在酸性條件下生成亞鐵氰化鐵,在700 nm處有吸收峰。從圖5可以看出,在樣品濃度為0.2～1 mg/mL范圍內(nèi),余甘子多酚和茶多酚的總還原能力隨濃度的增加而增加,余甘子多酚的總還原能力低于茶多酚。

圖5 各個(gè)樣品總還原能力的測(cè)定

2.4.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 余甘子多酚類(lèi)物質(zhì)中的酚羥基提供電子可與DPPH自由基中的孤對(duì)電子有效的結(jié)合,從而清除DPPH自由基。從圖6可以看出,在樣品濃度為6～62 μg/mL范圍內(nèi),余甘子多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯優(yōu)于茶多酚,余甘子多酚和茶多酚對(duì)DPPH自由基清除的EC50值分別為為(9±0.01)和(27.1±0.05) μg/mL。因此,余甘子多酚成分對(duì)DPPH自由基的清除能力比茶多酚強(qiáng)。

圖6 DPPH自由基的清除能力

2.4.3 羥自由基清除率的測(cè)定 余甘子多酚類(lèi)物質(zhì)中的酚羥基作為供電子基團(tuán)與具有極強(qiáng)吸電子能力的羥自由基結(jié)合,從而清除羥自由基。從圖7可以看出,在樣品濃度為0.4～1.1 mg/mL范圍內(nèi),余甘子多酚對(duì)羥自由基的清除能力優(yōu)于茶多酚,當(dāng)樣品濃度升高,在濃度為1.1～2 mg/mL范圍內(nèi),余甘子多酚對(duì)羥自由基的清除能力稍低于茶多酚。進(jìn)一步考察余甘子多酚和茶多酚對(duì)羥自由基清除的EC50值分別為(0.47±0.01)和(0.63±0.03) mg/mL。因此,余甘子多酚對(duì)羥自由基的清除能力優(yōu)于茶多酚。

圖7 多酚對(duì)羥自由基的清除作用

2.4.4 對(duì)小鼠自發(fā)性肝脂質(zhì)氧化的抑制作用 肝脂質(zhì)氧化產(chǎn)生大量的丙二醛及其它醛類(lèi)物質(zhì),丙二醛可與TBA生成有色化合物在532 nm處有吸收峰。從圖8中可以看出,在樣品濃度為40～130 μg/mL范圍內(nèi),余甘子多酚對(duì)自發(fā)性肝脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用明顯優(yōu)于茶多酚,余甘子多酚對(duì)肝脂質(zhì)過(guò)氧化抑制的EC50值為(122±2) μg/mL。因此,余甘子多酚成分對(duì)自發(fā)性肝脂質(zhì)氧化的抑制能力比茶多酚強(qiáng)。

圖8 樣品對(duì)肝脂質(zhì)氧化的抑制作用

3 結(jié)論

浸提時(shí)間、浸提溫度、乙醇濃度對(duì)余甘子多酚提取都有很大的影響。本實(shí)驗(yàn)以浸提時(shí)間為135 min、浸提溫度為70 ℃、乙醇濃度為45%,所提取的余甘子多酚為(0.2427±0.008) mg GAE/mg,提取效果較好。通過(guò)對(duì)總還原能力、DPPH自由基和羥自由基清除率、自發(fā)性肝脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性的測(cè)定,表明余甘子多酚的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、自發(fā)性肝脂質(zhì)氧化抑制率均明顯高于茶多酚,可以作為抗氧化劑替代品用于食品的抗氧化,也可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為功能性食品的添加物。