董昕/品測（上海）檢測科技有限公司

0 引言

喹諾酮類藥物（fluoroquinolones,FQs）是一種人工合成的廣譜抗菌藥。因其具有性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格便宜、抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，常作為飼料添加劑來預(yù)防和治療動物疾病[1]。但FQs會在動物體內(nèi)產(chǎn)生殘留，嚴(yán)重危害人體健康。歐盟、美國、日本等國相繼制定了喹諾酮類在動物組織中的最高殘留限量。2002年中國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定了牛、羊脂肪中的達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星的MRLs值為100 μg/kg。2016年中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2292號公告中禁止在動物食品中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星[2]。禽畜產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的殘留情況作為繼瘦肉精之后的又一個(gè)重點(diǎn)予以監(jiān)控，建立高效可靠的喹諾酮?dú)埩魴z測的方法勢在必行。

喹諾酮類藥物的檢測方法有微生物檢測法、免疫法（酶聯(lián)免疫法和免疫親和色譜法）、光譜法、高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等[3]。這些方法針對的基質(zhì)主要是動物肌肉組織。喹諾酮類藥物經(jīng)過食物鏈富集作用主要積聚于動物的肌肉和脂肪，而針對動物油脂中喹諾酮類藥物的檢測，相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)方法和文獻(xiàn)都較少。本實(shí)驗(yàn)以11種喹諾酮藥物為研究對象，建立了動物油脂中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，為動物油脂類產(chǎn)品中獸藥殘留的監(jiān)測提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters公司，H-CLASS型液相，配AB公司API-5500 Triple Quad型串聯(lián)質(zhì)譜檢測器）；ME204型分析天平(瑞士梅特勒公司托利多)；超純水系統(tǒng) (美國Millipore公司)；高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)；Talboys旋渦振蕩器(美國Talboys公司)、超聲儀（上海安譜公司）。

正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、凈化柱（PRIME HLB柱）：6 mL、200 mg或相當(dāng)者（沃特世公司）。色譜柱 ：BEH C18 2.1×50 mm，1.7 μm（沃特世公司）。

11種喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星、氟甲喹、惡喹酸、沙拉沙星），純度≥98%，由上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司提供。市售豬油。

1.2 樣品提取

稱取1.0 g試樣于離心管中，加入5 mL正己烷渦旋溶解，加入10 mL 80%乙腈水（0.1%甲酸）溶液渦旋5 min，常溫超聲10 min，4 000 r/min冷凍 （4℃）離心5 min，取下層乙腈水層上樣PRIME HLB小柱，濾出液過0.22 μm濾膜后供LC-MS/MS檢測。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取11種喹諾酮類獸藥 10 mg（精確到 0.1 mg），至 10 mL 棕色容量瓶中用甲醇定容至分度，得到各喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 000 μg/mL）。于 -20 ℃以下避光儲存，使用期限不超過6個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別量取適量的喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用20%乙腈水稀釋制備成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18，2.1 mm×50 mm，1.7 μm；流動相：A乙腈 B 0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨水；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；色譜柱溫度：30 ℃；洗脫梯度 ：0 min（10%A） 0.5 min（10%A） 1.5 min（30%A）3.0 min（90%A）4.0 min（90%A）4.01 min（10%A） 5.0 min（10%A）。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：MRM；掃描時(shí)間窗口設(shè)置：0～5 min；氣簾氣：30 psi；碰撞氣：Medium；離子化電壓：5 500 V；離子源溫度：600 ℃；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：60 psi；母離子，子離子及去簇電壓，碰撞能量保留時(shí)間見表1。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)每種化合物的響應(yīng)強(qiáng)弱，配制不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以各化合物峰面積(Y)對其濃度(X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明每個(gè)化合物在各自的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)r均不低于0.99（表2）。

表1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜11種喹諾酮類獸藥母離子，子離子及去簇電壓，碰撞能量

以空白油脂樣為樣品，加入喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.2方法進(jìn)行處理，依照不同倍數(shù)稀釋，通過LC-MS/MS檢測，以定量離子信噪比（S/N）≥10為界限，確定其最低檢出限，以稱樣量1.0 g計(jì)，得最低檢出限為 1.0 μg/kg。

表2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法11種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 結(jié)果計(jì)算

X=CV/m

式中：X——試樣中各喹諾酮類藥物含量，μg/kg；

m——樣品質(zhì)量，g；

V——樣品定容體積，mL；

C——測定用樣液中各喹諾酮類藥物濃度，ng/mL

2.3 回收率及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

以豬油為樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)量值分別為1倍檢出限、2倍檢出限、10倍檢出限進(jìn)行6平行試驗(yàn)，按照1.2方法分別進(jìn)行處理，通過LCMS/MS 分析（結(jié)果見表 3）。加標(biāo)量 1.0 μg/kg，各喹諾酮類藥物平均回收率88.2%～97.9%，精密度1.23%～5.69%；加標(biāo)量 2.0 μg/kg，各喹諾酮類藥物平均回收率87.5%～96.5%，精密度1.83%～3.37%；加標(biāo)量10.0 μg/kg，各喹諾酮類藥物平均回收率88.8%～93.6%，精密度1.52%～5.18%；符合回收率在80%～110%之間，精密度≤10%要求。

表3 豬油試樣PRIME HLB柱回收率添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果討論

3.1 提取和凈化

針對動物油脂的特點(diǎn)，其主要成分是脂肪酸，易溶于非極性溶劑，比較石油醚，環(huán)己烷，正己烷，發(fā)現(xiàn)油脂在正己烷中溶解最佳，因此本實(shí)驗(yàn)選擇正己烷為溶劑。溶解油脂樣品后采用乙腈、酸化乙腈、酸化乙腈水分別提取。酸化乙腈相較于乙腈，提取效果更優(yōu)；對于使用PRIME HLB柱，發(fā)現(xiàn)在乙腈水比例為8∶2時(shí)（0.1%甲酸）提取效率和對PRIME HLB柱的通過率均最佳，因此選取80%乙腈水（0.1%甲酸）為提取溶劑。

喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)中分子都含有羧基和哌嗪基，顯示出酸堿兩性，易溶于酸性或堿性溶液。通過80%乙腈水（0.1%甲酸）提取后，提取液直接通過PRIME HLB柱凈化。PRIME HLB柱是在水可浸潤性O(shè)asis吸附劑為基礎(chǔ)而特殊設(shè)計(jì)的一種SPE,它無需活化和平衡步驟能去除95%以上基質(zhì)干擾物（比如鹽，蛋白和磷脂），并且溶液流速更快，使得整個(gè)操作更順暢、快速，且對油脂有很好的凈化效果，有很好的適用性，適合推廣使用。

3.2 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

本方法優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測11種喹諾酮，使用BEHC18色譜柱，以乙腈和0.1%甲酸+2 mmol/L甲酸銨水為流動相，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min,能使得11種喹諾酮得到很好的分離，發(fā)揮了質(zhì)譜的高通量特性，使整個(gè)分析時(shí)間縮短到5.0 min以內(nèi)，大大地縮短了11種喹諾酮類的分析檢測時(shí)間，提高檢測靈敏度，且無雜質(zhì)干擾，節(jié)省了溶劑的耗費(fèi)和檢測的時(shí)間成本。11種喹諾酮類總離子流見圖1，陰性豬油樣品總離子流見圖2。

4 結(jié)語

圖1 11種喹諾酮類總離子流

圖2 陰性豬油樣品總離子流

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物油脂中11種喹諾酮類藥物的檢測方法。采用固相萃取柱凈化，BEHC18色譜柱超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測器檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用正己烷溶解油脂樣品，經(jīng)PRIME HLB柱凈化，BEHC18色譜柱超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，流程簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。本方法提取效率高，凈化過程簡單，靈敏度高，分析時(shí)間短，回收率滿意，適合推廣。