王圓圓 劉曉菲 張 洋 韓 笑 李斐斐

近年來,全球乳腺癌發(fā)病率攀升,已位居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位[1]。乳腺癌癌前病變(breast precancerous lesion)是癌變過程中必經(jīng)環(huán)節(jié),阻斷和逆轉其癌變是有效預防乳腺癌的關鍵。發(fā)揮中醫(yī)藥個體化治療的優(yōu)勢，對乳腺癌的二級預防，降低其發(fā)病率具有重要意義。我們課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)疏肝健脾方能夠調節(jié)乳腺增生大鼠的性激素,降低VEGF和bFGF的表達，抑制增生腺體的血管形成，并通過降低乳腺組織的PCNA和Bcl-2的表達活性，增加bax表達，抑制乳腺組織細胞的增殖，促進細胞的凋亡[2]。因此本次課題旨在進一步研究中藥疏肝健脾飲對乳腺癌MCF-10AT細胞增殖抑制及誘導凋亡的影響，探討疏肝健脾飲對乳腺癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與動物來源 細胞株：MCF-10AT細胞株(中國科學院上海生科院細胞資源中心有售)。藥物：疏肝健脾飲由柴胡12 g、青皮12 g、茯苓15 g、薏苡仁30 g、莪術9 g組成。制劑：柴胡、青皮、莪術三味藥材加入10倍量的水提取揮發(fā)油6 h，收集揮發(fā)油，另器保存?zhèn)溆?；薏苡仁、茯苓與提取揮發(fā)油后的藥渣加入12倍量水煎煮3次，每次1 h，煎液與提取揮發(fā)油后的藥液合并，濾過，濃縮至1∶1.5(藥材∶藥液)，加入乙醇使含醇量達到60%，靜置24 h，取上清液，沉淀部分離心，合并提取液，減壓回收乙醇后，濃縮至相對密度1.18(60 ℃)備用。另將揮發(fā)油與吐溫-80混勻，加入薏苡仁、茯苓等藥物提取液中，混勻，再加入蔗糖，山梨酸，調節(jié)PH值并用水調整至濃度0.78 g/ml。采用上述水提醇沉法制備各拆方組，疏肝理氣組(柴胡12 g、青皮12 g)，濃度0.24 g/ml；健脾化痰組(茯苓15 g、薏苡仁30 g)，濃度0.45 g/ml；活血化瘀組(莪術9 g)，濃度0.09 g/ml。他莫昔芬(TAM)制備：溶于生理鹽水，濃度為0.03 mg/ml。(購于上海旭東海普藥業(yè))。

1.1.2 藥物與試劑 胎牛血清(fetal bovine serum)、高糖DMEM細胞培養(yǎng)液，青霉素、鏈霉素(北京碧云天生物技術研究所)，DMSO、胰蛋白酶粉(Trypsin)、MTT(Amresco公司)。凋亡及周期檢測試劑盒，Annexin V-FITC/PI試劑盒(北京大學人類疾病基因研究中心)。其余常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗分組細胞對照組:不加任何處理因素。

1.1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司產(chǎn)品)；MTT(Amresco公司)；FACSCalibur 流式細胞儀(美國BD公司產(chǎn)品)；凋亡及周期檢測試劑盒，Annexin V-FITC/PI試劑盒(北京大學人類疾病基因研究中心)； ClassⅡ2085型超凈工作臺(美國Thermo Forma公司產(chǎn)品)，臺式離心機(上海盧湘儀器);旋轉蒸發(fā)儀(天津科諾儀器);電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 將120只裸鼠隨機分成6組，每組20只，模型對照組、疏肝健脾飲組、疏肝理氣組、健脾化痰組、活血化瘀組、他莫昔芬組。分別給予生理鹽水、疏肝健脾飲及各拆方、他莫昔芬灌胃，每天1次，灌胃液體量均為0.4 ml/(天·只)，疏肝理氣組濃度0.24 g/ml；健脾化痰組濃度0.45 g/ml；活血化瘀組濃度0.09 g/ml。他莫昔芬濃度為0.03 mg/ml，連續(xù)給藥15天。末次給藥2 h后經(jīng)下腔靜脈采血，離心后取血清-80 ℃凍存?zhèn)溆谩嶒炗盟帟r加入完全培養(yǎng)基使藥物血清濃度為20%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞的培養(yǎng) 用含 10%胎牛血清 100 U/ml慶大霉素的 DMEM/F-12培養(yǎng)液在37.5% CO2培養(yǎng)箱中孵育乳腺癌MCF-10AT細胞，每24 h換液傳代，隨機選取對數(shù)期生長的乳腺癌細胞株MCF-10AT細胞分成6份，CO2培養(yǎng)箱中孵育MCF-10AT細胞每24 h換液傳代。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 乳腺癌細胞株MCF-10AT按每瓶10×104接種，5% CO2，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)至貼壁，設模型對照組、疏肝健脾飲組、疏肝理氣組、健脾化痰組、活血化瘀組、他莫昔芬組共6組，每組加入實驗用藥，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，分別收集舊培養(yǎng)基，PBS清洗，滴入胰酶消化，1 200 r/min離心6 min，收集各時間點細胞。將各組細胞經(jīng)PBS 液漂洗2次，按Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒試劑盒操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期，每份標本計數(shù)10000個細胞，實驗重復3次。

1.2.4 MTT比色法檢測藥物對細胞的抑制率 取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞株 MCF-10AT按每孔4000個細胞/100 μl ，將細胞重懸，接種于96孔板，貼壁24 h，加入相同的培養(yǎng)液，將細胞培養(yǎng)24、48 和72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 液15 μl，繼續(xù)孵育4 h后，棄去各孔原溶液加DMSO 150 μl，放于搖床上搖動10 min，使用多功能酶標儀測定波長570 nm下吸光度(A)，每組6個復孔，取其平均值計算細胞存活率。細胞抑制率=(對照組OD550-試驗組OD550)/對照組OD550×100%。實驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

與模型對照組相比，疏肝健脾飲組、疏肝理氣組、健脾化痰組、活血化瘀組、他莫昔芬組對MCF-10AT細胞具有明顯抑制作用。且隨著藥物作用時間延長(24、48、72 h)，平均抑制率逐漸增高，呈現(xiàn)時間依賴效應，有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

分別在24 h、48 h、72 h測得各組抑制率之間差別均有統(tǒng)計學意義(F=63.208、21.716、36.457，P<0.05),各時間點抑制作用以他莫昔芬組最為顯著，其次為疏肝健脾飲組、疏肝理氣組，而健脾化痰組、疏肝理氣活血化瘀組兩組抑制作用較弱。他莫昔芬組抑制率在24 h已較為明顯，隨著作用時間延長，抑制率不斷增加，中藥各組在24～48 h抑制率增長幅度明顯高于他莫昔芬組，48 h后疏肝健脾飲組與他莫昔芬組間抑制率無明顯統(tǒng)計學差異(P=0.069)(表1)。

流式細胞儀檢測細胞凋亡結果，將各組細胞分別利用流式細胞儀對細胞凋亡進行定量檢測。結果顯示，各處理組細胞凋亡率與空白對照組比較均顯著增加，以他莫昔芬組增加最為明顯，依次為疏肝健脾飲組、疏肝理氣組、健脾化痰組(P<0.05)、活血化瘀組。疏肝健脾飲組與他莫昔芬組明顯高于疏肝理氣組、健脾化痰組和活血化瘀組(P=0.000)(表1)。

表1 各組對細胞株MCF-10AT的生長抑制及凋亡的影響

注：與模型對照組相比，*為P<0.05，與他莫昔芬組對比，△為P<0.05，與疏肝健脾飲組對比，▲為P<0.05。

3 討論

《瘍科心得集·辨乳癖乳痰乳巖論》中亦云“夫乳巖之起也,由于憂郁思慮積想在心,所愿不遂,脾氣逆,以致經(jīng)絡痞塞,結聚成核”。說明情志不舒，肝氣郁滯，橫逆犯脾,脾失健運,清陽不升,濁陰不降,留于中焦,滯于膈間,生濕聚痰,結于乳絡致乳絡阻塞不通而變生乳巖。又因沖任之氣血,上行為乳,下行為月水,若沖任失調,氣血瘀滯,積聚于乳房胞宮,則乳痛或月事紊亂,氣滯血瘀痰凝而導致乳內結塊。裴曉華等還認為“毒瘀互結”證可以看作是乳腺癌癌前病變特有的階段[3]。故根據(jù)以上病因病機的分析，對于乳腺癌的治療應以疏肝理氣、活血化瘀為基本原則。此前李湘奇等人也研究表明，以疏肝健脾為主要功效的乳康飲對人乳腺癌細胞MDA-MB-435S有明顯的增殖抑制效應，而且能夠誘導人乳腺癌細胞 MDA-MB-435S的凋亡[4]。本實驗中柴胡的主要活性成分為柴胡皂苷，可多途徑的調節(jié)基因促進細胞的凋亡[5]。青皮的成分被研究發(fā)現(xiàn)可通過影響VEGF-C誘導的淋巴管生成抑制乳腺癌淋巴結轉移[6]。茯苓多糖為茯苓的主要活性成份,對小鼠Sarcoma180腫瘤細胞有殺傷和誘導凋亡的作用[7]。薏苡仁中的兩種抗腫瘤活性成分薏苡仁多糖和薏苡仁油 具有較好的抗腫瘤作用[8]。莪術油可降低乳腺癌癌前病變模型大鼠的癌變發(fā)生率及死亡率,可在癌前病變階段預防、逆轉、阻斷乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[9]。并且莪術油能夠降低DMBA(7,12-二甲基苯蒽)誘導大鼠乳腺癌癌前病變組織中上皮細胞的增殖活性，改善乳腺癌癌前病變造模大鼠的血液流變學,增加乳房的微循環(huán)灌注量,是其治療和預防乳腺癌癌前病變的機理之一[10]。

乳腺癌的生成是腫瘤細胞增殖及凋亡平衡失調的結果：細胞周期失控導致細胞過度增殖,但更重要的是細胞凋亡受阻,直接導致了衰老、受損及異常細胞的生命延長[11]。因此,有效抑制乳腺癌細胞增殖并誘導其凋亡的同時降低其侵襲能力是防治乳腺癌的關鍵。本實驗通過流式細胞術及MTT比色法檢測細胞周期、細胞凋亡及腫瘤生長的情況，與模型對照組相比，各實驗組中細胞的凋亡率及抑瘤率隨時間的延長均有不同程度升高，其中疏肝健脾飲組、他莫昔芬組升高最明顯，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。在細胞增殖實驗中，疏肝健脾飲組抑制細胞增殖的作用及起效時間均優(yōu)于其他拆方組，而疏肝理氣組作用要強于健脾化痰組及活血化瘀組，推測疏肝理氣組中的中藥成分對腫瘤抑制作用要偏強于健脾化痰組及活血化瘀組。本方中柴胡舒肝氣，暢氣血；青皮疏肝散結，二者共為君藥；茯苓健脾補中，滲濕利水，與柴胡合用，行氣以助行水，疏肝木而補脾土；薏苡仁甘補淡滲，功似茯苓，二藥共為臣藥，共奏化痰滲濕之功；莪術乃治積聚諸氣最要之藥，既能助柴胡行氣以止痛，又能破血以逐瘀，為佐使藥。諸藥相合，疏肝同時健脾，理氣不忘化瘀。各中藥成分間有著相互促進作用，故其拆方的作用效果明顯低于全方。

目前為止，他莫昔芬仍是絕經(jīng)前ER陽性乳腺癌術后患者第一線抗雌激素藥物。但它同時刺激ER陽性的子宮內膜細胞增生，使子宮內膜呈現(xiàn)出了息肉-增生-惡性變等多樣的變化[12-13]。后期相應的治療如反復刮宮等，給患者帶來一系列的痛苦。因此，尋找與他莫昔芬療效相當，毒副作用少的中藥制劑，具有很大的潛力和發(fā)展前景。本實驗研究表明疏肝健脾飲可以抑制乳腺癌細胞MCF-10AT的增殖，并促進其凋亡。由于各拆方中仍含有不等的有效成分，如何調整方劑組成及各藥物用量使得疏肝健脾飲發(fā)揮最大療效仍需進一步的實驗論證，結果理想后有望將疏肝健脾飲應用于臨床，為患者帶來福音。