陶俊燁， 丁選勝*， 吳正紅， 丁雨寅， 宋征宇， 王 勤

（1. 中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院， 江蘇 南京211100； 2. 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京211100）

淫羊藿苷是從淫羊藿干燥葉中提取出的有效成分之一, 具有促進(jìn)骨代謝[1]、 增強(qiáng)生殖功能[2-3]等多種藥理作用, 近年來該成分對心血管疾病的改善作用逐漸被人們所重視[4], 同時(shí)它對糖尿病及其并發(fā)癥也有一定療效[5]。 但淫羊藿苷在水中的溶解性較低[6], 故在一定程度上限制了相關(guān)新藥的開發(fā)。

目前, 已有關(guān)于淫羊藿苷穩(wěn)定性和溶解度的報(bào)道[6-7], 但對其降解動力學(xué)的研究還比較少。由于人體胃腸道中具有不同的pH 和化學(xué)環(huán)境[8],本實(shí)驗(yàn)將探究淫羊藿苷在不同pH 緩沖液中的穩(wěn)定性, 以及在不同pH、 溫度、 緩沖液中的降解動力學(xué)行為, 以期為該成分進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

SPD20-A 高效液相色譜儀（配置LC-20AT 溶劑輸送泵、 UV-VIS 檢測器、 Rheodyne 7725i 手動進(jìn)樣閥、 LC Solution 工作站, 日本島津公司）；RPL-D2000 柱溫箱（大連日普利科技儀器有限公司）； PHS-3C 雷磁PH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）； CPA225D 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司]； ZYC-200B 恒溫?fù)u床（上海溪乾儀器設(shè)備有限公司）； 80-2 電動離心機(jī)（常州國宇儀器制造有限公司）； DF-101SA-H 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）； 超聲波清洗機(jī) （上海比朗儀器制造有限公司）。

淫羊藿苷原料藥（陜西錦泰生物工程有限公司, 批號JT171010, 含有量＞98%）； 淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院, 批號110737-201516, 含有量94.2%）。 鹽酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司, 批號170320098H, 含有量36% ～38%）； 氫氧化鈉（西隴化工股份有限公司, 批號1112021）； 十二水合磷酸氫二鈉（西隴科學(xué)股份有限公司, 批號171221）； 磷酸二氫鈉 （批號030210109）、 一水合枸櫞酸（批號150505182K）、三水合枸櫞酸三鈉 （批號160306063U）、 乙酸（批號171012355F） （南京化工試劑股份有限公司；無水乙酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 批號20170301）； 甲醇（批號21171001）、 乙腈（批號011370501） 為色譜純（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿苷含有量測定

2.1.1 色譜條件 Hedera ODS-2 色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動相乙腈-水（3.4 ∶6.6）； 檢測波長270 nm； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 溶液制備 精密稱取淫羊藿苷對照品20 mg于小燒杯中, 少量甲醇溶解后移入100 mL 量瓶中,甲醇定容至0.2 mg/mL, 即得對照品溶液。 精密稱取淫羊藿苷原料藥20 mg, 甲醇制成每1 mL 含0.4 mg該成分的溶液, 即得供試品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 按照2015 年版《中國藥典》[9]方法, 精密量取對照品貯備液2.5、 5.0、10.0、 20.0 mL, 置于50 mL 量瓶中, 流動相稀釋并定容, 搖勻, 得10、 20、 40、 80 μg/mL 對照品溶液, 將10 μg/mL 溶液分別稀釋2、 4 倍, 得到2.5、 5 μg/mL, 0.45 μm 有機(jī)系濾頭過濾, 取中間段續(xù)濾液, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測定, 每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3 次。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸,得方程為Y=51 919X+49 687 （r=0.999 8）, 在2.5～80 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 專屬性考察 取流動相、 供試品溶液、 對照品溶液, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測定, 再取配制好的400 μL 母液, 稀釋1 倍后加入人工腸液和大鼠回腸液以加速其降解, 在選定時(shí)間取20 μL, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖1。 由圖可知, 淫羊藿苷峰型良好, 溶劑峰不產(chǎn)生干擾, 降解產(chǎn)物無干擾[10]。

圖1 淫羊藿苷HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of icariin

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液, 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次, 測得淫羊藿苷峰面積RSD 為0.6%, 表明儀器精密度良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取對照品1.6、2.0、 2.4 mg, 置于10 mL 量瓶中, 甲醇溶解并稀釋至刻度, 量取5 mL 至50 mL 量瓶中, 流動相稀釋至20、 40、 80 μg/mL, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定3 次, 測得淫羊藿苷平均加樣回收率為99.86%, RSD 為1.59%。

2.1.7 檢測限考察 對照品溶液用流動相逐步稀釋, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定, 以峰高接近基線噪音3 倍時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測限, 測得其為1.25 μg/mL。

2.1.8 緩沖液配制[10-12]

2.1.8.1 磷酸鹽緩沖液（調(diào)節(jié)pH 用） 磷酸二氫鈉溶液： 精密稱取磷酸二氫鈉24.00 g, 加水溶解后置于1 000 mL 量瓶中, 定容至刻度, 即得（0.2 mol/L）。

磷酸氫二鈉溶液, 精密稱取十二水合磷酸氫二鈉71.63 g, 加水溶解后置于1 000 mL 量瓶中, 定容至刻度, 即得（0.2 mol/L）。

然后, 將2 種溶液按照一定比例混合, 再用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH （微量, 幾乎不影響體積）, 即得（0.2 mol/L）。

2.1.8.2 磷酸鹽緩沖液（測定動力學(xué)參數(shù)用）磷酸二氫鈉溶液, 精密稱取磷酸二氫鈉1.2、 3.6、6.0 g, 加水溶解后置于100 mL 量瓶中, 定容至刻度, 即得（0.1、 0.3、 0.5 mol/L）。

磷酸氫二鈉溶液, 精密稱取十二水合磷酸氫二鈉3.58、 10.74、 17.91 g, 加 水 溶 解 后 置 于100 mL量瓶中, 定容至刻度, 即得 （0.1、 0.3、0.5 mol/L）。

然后, 將2 種溶液按照一定比例混合, 氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH, 即得（0.1、 0.3、 0.5 mol/L）。

2.1.8.3 醋酸鹽緩沖液 醋酸鈉溶液, 精密稱取醋酸鈉0.82、 2.46、 4.10 g, 加水溶解后置于100 mL量瓶中, 定容至刻度, 即得 （0.1、 0.3、0.5 mol/L）。

醋酸溶液, 精密量取冰醋酸0.57、 1.7、2.85 mL, 加水溶解后置于100 mL 量瓶中, 定容至刻度, 即得（0.1、 0.3、 0.5 mol/L）。

然后, 將2 種溶液按照一定比例混合, 氫氧化鈉溶液調(diào)pH, 即得（0.1、 0.3、 0.5 mol/L）。

2.1.8.4 枸櫞酸鹽緩沖液 枸櫞酸溶液, 精密稱取一水合枸櫞酸2.10、 6.30、 10.5 g, 加水溶解后置于100 mL 量瓶中, 定容至刻度, 即得 （0.1、0.3、 0.5 mol/L）。

枸櫞酸鈉溶液, 精密稱取三水合枸櫞酸鈉3.12、 9.36、 15.6 g, 加水溶解后置于100 mL 量瓶中, 定容至刻度, 即得（0.1、 0.3、 0.5 mol/L）。

然后, 將2 種溶液按照一定比例混合, 氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH, 即得（0.1、 0.3、 0.5 mol/L）。

2.2 淫羊藿苷穩(wěn)定性研究 取淫羊藿苷適量, 甲醇溶解并定容至刻度, 制成每1 mL 含400 μg 該成分的溶液, 精密量取8 份, 每份1 mL, 置于10 mL量瓶中, 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度, 調(diào)pH 為1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8, 搖勻, 避光, 在25 ℃下放置。 然后, 于第0、 2、 4、 6、 8、 12、24 h 取樣, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算保留率, 公式為保留率=Ct/C0×100%, 其中Ct為淫羊藿苷處理后質(zhì)量濃度, C0為淫羊藿苷初始質(zhì)量濃度。 結(jié)果見圖2。

圖2 淫羊藿苷保留率Fig.2 Retention rates of icariin

由圖可知, 12 h 內(nèi)淫羊藿苷在pH 1 ～8 磷酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性相對良好, 保留率都在97% 以上, 并隨著pH 增大呈逐漸上升的趨勢； 24 h 后,淫羊藿苷保留率均有所下降, 在酸性條件下更明顯。

2.3 淫羊藿苷降解動力學(xué)研究

2.3.1 pH 值 取淫羊藿適量, 甲醇溶解并定容至刻度, 制成每1 mL 含400 μg 該成分的溶液, 精密量取1 mL 至10 mL 量瓶中, 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度, 調(diào)pH 為1、 3、 4.5、 6、 6.8、 7、8 （由于胃腸道中pH 不同, 故選取幾個(gè)與人體胃腸道中不同部位pH 相似的點(diǎn)）, 搖勻, 分裝于6 mL 西 林 瓶 中, 密 封, 于0、 6、 12、 36、 60、72 h取樣。 然后, 以降解一定時(shí)間后淫羊藿苷剩余濃度對數(shù)（lnC） 對時(shí)間（t） 作圖, 再按反應(yīng)動力學(xué)方法計(jì)算反應(yīng)級數(shù)及表觀降解速率常數(shù)（K）,結(jié)果見圖3、 表1。

由圖3 可知, 降解曲線具有線性, 基本符合一級動力學(xué)降解過程（R2＞0.860 0）； 由圖3、 表1可知, 淫羊藿苷在pH 6.8 時(shí)降解速率最小, 穩(wěn)定性最強(qiáng)。

圖3 淫羊藿苷在不同pH 下的降解曲線Fig.3 Degradation curves for icariin under different pH values

表1 淫羊藿苷在不同pH 下的動力學(xué)參數(shù)Tab.1 Kinetic parameters for icariin under different pH values

2.3.2 溫度 取淫羊藿苷適量, 甲醇溶解并定容至刻度, 制成每1 mL 含400 μg 該成分的溶液, 精密量取1 mL至10 mL 量瓶中, 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液定容至刻度, 調(diào)節(jié)pH 為6.8, 密封, 在4、25、 37、 60 ℃恒溫 水 浴 中 加 熱, 于0、 12、 24、36、 48、 60 h取樣。 然后, 將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度, 以某溫度降解一定時(shí)間后淫羊藿苷剩余濃度對數(shù)（lnC） 對時(shí)間（t） 作圖, 結(jié)果見圖4、 表2。

圖4 淫羊藿苷在不同溫度下的降解曲線Fig.4 Degradation curves for icariin under different temperatures

由此可知, pH 為6.8 時(shí), 淫羊藿苷在不同溫度下的降解均為一級反應(yīng), 而且溫度越高, 降解速率越快。

表2 淫羊藿苷在不同溫度下的動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Kinetic parameters for icariin under different temperatures

2.3.3 緩沖液 精密稱取淫羊藿苷適量, 甲醇溶解并定容至刻度, 制成每1 mL 含400 μg 該成分的溶液, 精密量取1 mL 至10 mL 量瓶中, 0.1、 0.3、0.5 mol/L 磷酸鹽、 檸檬酸鹽、 醋酸鹽緩沖液定容至刻度, 調(diào)pH 為6.8, 搖勻, 分裝入6 mL 西林瓶中, 密封。 然后, 將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度, 以降解一定時(shí)間后淫羊藿苷的剩余濃度對數(shù)（lnC） 對時(shí)間（t） 作圖, 再將緩沖降解所對應(yīng)的K 值繪圖, 結(jié)果見圖5～6、 表3。

圖5 淫羊藿苷在不同緩沖液中的降解曲線Fig.5 Degradation curves for icariin in different buffers

圖6 不同緩沖液對淫羊藿苷降解速率的影響Fig.6 Effects of different buffers on the degradation rate of icariin

表3 淫羊藿苷在不同緩沖液中的動力學(xué)參數(shù)Tab.3 Kinetic parameters for icariin in different buffers

由圖5、 表3 可知, 淫羊藿苷在不同緩沖液中的降解行為均為一級動力學(xué), 而且速率不同； 由圖6 可知, 淫羊藿苷的降解速率在磷酸鹽緩沖液中隨著鹽濃度升高而升高, 在檸檬酸鹽緩沖液中無明顯變化, 在醋酸鹽緩沖液中隨著鹽濃度升高而下降。

3 討論

大多數(shù)單體成分在貯存過程中可能會受到環(huán)境因素的影響而發(fā)生降解, 其動力學(xué)行為基本符合零級或一級模型[13]。 淫羊藿苷屬于中藥單體成分,其降解動力學(xué)研究結(jié)果表明, 它在不同pH 下的降解曲線呈線性, R 在0.9 以上[14-15]（≥0.81）, 即符合一級動力學(xué)特征； 在酸性環(huán)境下, 該成分降解速率大于弱酸性、 中性條件下, 在pH 6.8 時(shí)最小,即此時(shí)穩(wěn)定性最強(qiáng)； 隨著溫度上升, 該成分降解速率增大, 在人體體溫（37 ℃） 下其降解速率K 值是室溫下的2 倍。 本實(shí)驗(yàn)選用了3 種常見緩沖液,每種3 個(gè)濃度, 發(fā)現(xiàn)在25 ℃、 pH 6.8 時(shí), 磷酸鹽緩沖液中淫羊藿苷降解速率與鹽濃度呈正比, 檸檬酸鹽緩沖液中無明顯變化, 醋酸鹽緩沖液中與鹽濃度呈反比。

另外, 本實(shí)驗(yàn)雖然模擬了人體胃腸道的pH,但并無酶參與, 與內(nèi)環(huán)境有一定差異, 這也是今后需要進(jìn)一步研究的方向。