賈玉敏，范亞平，蔣 霞，解心悅，施釗鈺，袁 莉

常染色體顯性遺傳性多囊腎（autosomal dominant polycystic kidney，ADPK）是最常見的腎臟遺傳性疾病，由兩個主要基因PKD1（80%～85%）和PKD2（15%～20%）的突變引起［1］。與 PKD2 突變型相比，PKD1突變型患者終末期腎病發(fā)生時間要早20年［2］。ADPK的外顯率近100%，患者子女的再發(fā)風(fēng)險為50%，基因檢測可以早期確診，明確致病變異，可通過遺傳咨詢有針對性地指導(dǎo)家系管理（包括家系的臨床篩查和產(chǎn)前診斷）。該文報道通過新一代測序明確由PKD1基因雜合移碼變異導(dǎo)致的ADPK家系1例。

1 資料與方法

1.1 臨床資料先證者，男，49歲，2010年因夜尿增多就診，查肌酐156μmol/L，彩超提示多囊腎，多囊肝。2014年肌酐升至1136μmol/L開始血液透析治療，無多囊腎家族史（圖1、2）?；颊吲畠?5歲，目前腎功能正常，B超未提示有典型PKD腎臟病變。影像學(xué)檢查：先證者2018年泌尿系統(tǒng)B超見右腎大小237 mm×103 mm×109 mm，左腎大小279 mm×120 mm×134 mm，雙腎布滿大小不等之液性暗區(qū)，左側(cè)最大80 mm×71 mm，右側(cè)最大60 mm×37 mm；左右腎內(nèi)見數(shù)枚強光團，最大直徑5 mm；提示多囊腎，雙腎結(jié)石（圖 2）。

圖1 多囊腎病家系圖

圖2 先證者多囊腎B超圖

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集與DNA提取 經(jīng)知情同意后，采集先證者及其女外周靜脈血各3 ml，置于ETDA抗凝管中，使用TIA Namp Blood DNA Kit（北京天根生化科技有限公司，中國）血液試劑盒從外周血淋巴細(xì)胞中提取基因組DNA。

1.2.2 Long-PCR 由于PKD1基因特殊性，可分為單拷貝區(qū)域和多拷貝區(qū)域。在多拷貝區(qū)域中，基因組序列BLAT結(jié)果顯示6個假基因序列與目標(biāo)序列相似度高達(dá)98%～99%左右，尋找PKD1真基因與假基因的細(xì)微序列差異，挑選PKD1基因第1號外顯子到第34號外顯子間的差異序列進(jìn)行引物設(shè)計，共設(shè)計長片段引物4對。同時，PKD1基因單拷貝區(qū)域和PKD2基因設(shè)計長片段引物6對。PCR擴增采用Applied Biosystems Veriti 96孔熱循環(huán)PCR儀，擴增產(chǎn)物用Agencourt AMPure XP磁珠純化后，使用Qubit 2.0分別定量，并以相等的摩爾比合并。

1.2.3 Illumina測序及生物信息學(xué)分析 將2 mg LR-PCR產(chǎn)物合并在200 ml Tris-EDTA緩沖液中，并使用Covaris法隨機打斷成長度為180～280 bp的片段并回收。使用Agencourt AM Pure XP磁珠對樣本進(jìn)行進(jìn)一步純化。構(gòu)建Illumina測序文庫時將回收片段進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，將測序特定接頭（Adapter）同末端修復(fù)產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)Adapter上的通用引物結(jié)合位點進(jìn)行產(chǎn)物的擴增反應(yīng)，純化回收產(chǎn)物。帶有特異index的文庫pooling后與生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來，經(jīng)PCR線性擴增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后用Illumina Next Seq 500測序儀進(jìn)行測序。

原始圖像文件經(jīng)過Illumina base calling Software 1.7進(jìn)行堿基讀取，獲得讀長為90 bp雙末端序列reads。去除低質(zhì)量和污染的reads，去除Adapter序列得到純化數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對分析，用soap軟件分析拷貝數(shù)、多態(tài)性和插入/缺失，并且進(jìn)行注釋篩選可疑致病突變。并經(jīng)SIFT（http：//sift.jcvi.org/） 和 Polyphen 軟 件 （http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph/）等蛋白預(yù)測軟件對其進(jìn)行蛋白功能預(yù)測。

1.2.4 Sanger測序驗證 根據(jù)新一代測序所得基因突變位點序列設(shè)計引物，對患者及其女目標(biāo)序列進(jìn)行Sanger測序，分析測序結(jié)果。采用PCR方法擴增，反應(yīng)條件為：25μl的反應(yīng)體系中包含10×擴增緩沖液 2.5μl，94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 40 s，57℃退火 40 s，72℃延伸 60 s條件循環(huán) 35次后72℃延伸10 min。見表1。

2 結(jié)果

通過對目標(biāo)序列及側(cè)翼區(qū)進(jìn)行詳盡分析，發(fā)現(xiàn)該受檢者攜帶PKD1基因c.10396_10397delTC（Ala3467Ilefs＊3）雜合移碼變異，是ADPK的致病變異。PKD1基因c.10396_10397delTC變異發(fā)生在第33號外顯子上，該變異使PKD1基因編碼區(qū)第10396至10397位的胸腺嘧啶脫氧核苷酸（T）、胞嘧啶脫氧核苷酸（C）缺失，導(dǎo)致其編碼的蛋白第3467位氨基酸由丙氨酸（Ala）變?yōu)楫惲涟彼幔↖le），并在其后第2位提前出現(xiàn)終止密碼子，可能導(dǎo)致蛋白截短表達(dá)，影響其功能。該變異未見人群頻率報道（數(shù)據(jù)來源：1000G、ExAC、esp6500 和 gnomAD），是一個罕見變異。見圖3。

表1 Sanger測序引物序列表

圖3 基因測序圖

3 討論

ADPK是由腎小管上皮細(xì)胞基因突變引起的，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和囊腫形成，并進(jìn)展至慢性腎病［3］。PKD1基因?qū)е碌腁DPK可于任何年齡發(fā)病，多于青中年時期被發(fā)現(xiàn)，以雙側(cè)多發(fā)腎囊腫為主要特點，伴隨腎功能異常、高血壓、腎痛、腎結(jié)石、尿路感染等。除腎囊腫外，患者也可出現(xiàn)其他器官囊腫，包括肝臟、精囊、胰腺和蛛網(wǎng)膜等［4］。

ADPK的臨床診斷依賴于家族史及腎臟影像學(xué)表現(xiàn)（如超聲、CT及MRI），然而年輕人影像學(xué)結(jié)果往往模糊不清，特別對于無家族史的患者，早期明確診斷仍有難度。該文先證者無多囊腎家族史，其女亦無異常腎臟的影像學(xué)資料提示。所以，基因檢測在ADPK患者的早期診斷中發(fā)揮著重要作用，而且隨著對ADPK潛在有效藥物治療的發(fā)展，對準(zhǔn)確診斷基因檢測的需求也越來越迫切［5］。

在ADPK的突變分析過程中，要注意以下幾個方面：首先ADPK的突變分析被PKD1和PKD2的大尺寸和復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)、顯著的等位基因異質(zhì)性和帶有低營養(yǎng)等位基因的常見錯義突變所阻礙［6］，其次要注意真假基因的篩選。PKD1基因外顯子1至33與人類基因組16號染色體區(qū)域存在六段高度相似的序列，即在離PKD1基因13到16兆堿基處存在六個與其高度同源的假基因，與真基因序列同源性為97.7%［7］。此區(qū)域結(jié)構(gòu)復(fù)雜，部分區(qū)域GC含量高達(dá)70%甚至80%。而在檢測變異的PCR過程中往往同時擴增出這些同源假基因序列，導(dǎo)致對真突變基因的鑒定產(chǎn)生困難。測序前進(jìn)行LR-PCR可以有效避免這些假基因的PCR產(chǎn)物的污染，放大PKD1基因區(qū)域，同時避免假基因序列的干擾［8］。

該文中，筆者所在課題組使用了一種新的NGS PK基因分型方法，分析靈敏度及特異性分別為99.2%，99.9%，優(yōu)于單純Sanger測序方法。該方法基于PKD1和PKD2基因的LR-PCR擴增，使用10對精心設(shè)計的PCR引物覆蓋約68.0 kb的PKD基因組區(qū)域，相當(dāng)于 31.9 kb（68.8%）和 35.8 kb（51.0%）的PKD1和PKD2基因［9］。鑒于NGS技術(shù)對復(fù)雜結(jié)構(gòu)基因、GC含量高的區(qū)域檢測仍有欠缺之處，實驗使用新一代測序聯(lián)合Sanger驗證相互補充以確?；驒z測的準(zhǔn)確性。

該文的先證者病史及影像學(xué)檢查支持PKD的診斷，但無家族史，其女年僅20余歲，無PKD影像學(xué)診斷依據(jù)，針對該文2例患者，筆者所在課題組使用基于NGS的基因分型方法，該方法更適合于標(biāo)準(zhǔn)的臨床診斷設(shè)置，通過對每例患者進(jìn)行單獨條形碼編碼，可以實現(xiàn)快速周轉(zhuǎn)時間和高靈敏度。經(jīng)過檢測，發(fā)現(xiàn)先證者及其女?dāng)y帶的PDK1基因c.10396_10397delTC（Ala3467Ilefs＊3）變異為致病變異，該突變目前尚未見報道，該次發(fā)現(xiàn)豐富了PKD1的突變譜，有助于開展ADPK的基因診斷，同時對于該雜合移碼變異引起疾病的進(jìn)一步研究，將有助于對ADPK發(fā)病的分子學(xué)機制、基因突變類型和臨床表型關(guān)系的進(jìn)一步理解。

（感謝中科基因醫(yī)學(xué)檢驗所給予的技術(shù)支持）