李單祎 武 昕

一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物體內(nèi)一種生物調(diào)節(jié)性介質(zhì)，具有許多生物學(xué)活性，參與機(jī)體多種生理病理過程。NO具有擴(kuò)張血管，增加血管內(nèi)皮通透性，與血管生長因子相互作用，促進(jìn)血管生成的作用。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是作用于L—精氨酸和O2生成NO的關(guān)鍵酶，NOS包括三種同工酶，即神經(jīng)型(nNOS)，誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)。外陰色素減退性疾病，又稱外陰上皮非瘤樣病變，是一組以瘙癢為主要癥狀、外陰皮膚色素減退為主要體征的外陰皮膚疾病，主要包括外陰慢性單純性苔蘚(lichen simplex chronicus，LSC)和外陰硬化性苔蘚(lichen sclerosus，LS)，病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明[1]。LSC先前的疾病名“外陰鱗狀上皮增生”已不再采用。本研究目的是檢測iNOS和eNOS在外陰正常皮膚、LSC和LS中的表達(dá)，并以人原始造血細(xì)胞抗原(CD34)標(biāo)記微血管內(nèi)皮細(xì)胞，測量各組織的微血管密度(MVD)，探討iNOS和eNOS與LSC和LS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本 選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理教研室1998-2014年存檔的蠟塊：外陰慢性單純性苔蘚(LSC)30例，外陰硬化性苔蘚(LS)30例，外陰正常皮膚10例。

1.1.2 試劑 兔抗人iNOS、eNOS多克隆抗體(工作濃度1∶100)，兔抗人CD34多克隆抗體(工作濃度1∶80)，即用型SABC試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法 免疫組織化學(xué)SABC法。

1.2.2 結(jié)果判定 iNOS和eNOS蛋白定位在細(xì)胞漿中，以棕黃色顆粒細(xì)胞為陽性細(xì)胞。在高倍鏡下(400)任意選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)平均的陽性細(xì)胞數(shù)，取5個(gè)數(shù)值的平均數(shù)作為陽性細(xì)胞數(shù)。CD34蛋白主要定位于細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒。陽性標(biāo)準(zhǔn)按Weidner等[2]方法檢測，每張切片選擇3個(gè)血管最密集的區(qū)域(新生血管熱點(diǎn)區(qū))，在高倍鏡下(400)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均值作為MVD值。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)資料用SPSS 13.0進(jìn)行處理，各組計(jì)量資料的結(jié)果采用t檢驗(yàn)，比較iNOS和eNOS表達(dá)的一致性采用Kappa檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iNOS和eNOS在LSC和LS中的表達(dá) 在外陰正常皮膚中無表達(dá)。在LSC和LS中陽性細(xì)胞表達(dá)于真皮淺層，在表皮細(xì)胞中不表達(dá)。iNOS在LSC和LS中陽性細(xì)胞多表達(dá)于淋巴細(xì)胞、少量漿細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。eNOS在LSC和LS中陽性細(xì)胞多表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖1、2，棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞)。LSC中iNOS和eNOS的表達(dá)高于LS(P<0.05)。見表1。

2.2 CD34蛋白在外陰正常皮膚、LSC、LS中的表達(dá)及MVD值 CD34蛋白在外陰正常皮膚、LSC、LS中均呈陽性表達(dá)。CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在新生血管內(nèi)皮中表達(dá)遠(yuǎn)大于非新生血管內(nèi)皮(圖3、4，棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞)。LSC中MVD高于LS(P<0.05)，LS的MVD低于外陰正常皮膚(P<0.05)。見表2。

表1 iNOS和eNOS蛋白在LSC和LS中的表達(dá)

注：*表示P<0.05

圖1 iNOS在LSC中的陽性表達(dá)(SABC，×100) 圖2 eNOS在LS中的陽性表達(dá)(SABC，×100)圖3 CD34在LSC中的陽性表達(dá)(SABC，×100) 圖4 CD34在LS中的陽性表達(dá)(SABC，×100)

表2 外陰正常皮膚、LSC、LS中的MVD值

注：*表示P<0.05

2.3 iNOS和eNOS在LSC、LS中表達(dá)的關(guān)系 見表3。

3 討論

由NOS合成的NO是人體內(nèi)重要的信號分子，其功能復(fù)雜。生理濃度的NO(pmoL或fmoL水平)參與信息傳遞和細(xì)胞保護(hù)作用，而過量的NO(nmoL水平)見于病理刺激和炎癥反應(yīng)時(shí)。iNOS一經(jīng)誘導(dǎo)生成，即大量合成NO介導(dǎo)炎癥發(fā)生，誘導(dǎo)血管生成，可加重炎癥反應(yīng)過程。iNOS可間接激活eNOS，使其在病理情況下表達(dá)增加，經(jīng)eNOS產(chǎn)生的NO起到擴(kuò)張血管、增加微循環(huán)通透性的作用，保證血液供應(yīng)。CD34是一種血管內(nèi)皮標(biāo)志物，且敏感性較強(qiáng)，因此用CD34可測量組織內(nèi)微血管密度(MVD)，MVD是血管生成的定量指標(biāo)。

表3 iNOS和eNOS在LSC、LS中表達(dá)的關(guān)系

注：Kappa=0.811,P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)，在外陰正常皮膚中，無iNOS蛋白表達(dá)；在LSC中，iNOS蛋白表達(dá)上調(diào)。LSC主要病理表現(xiàn)為鱗狀上皮表層細(xì)胞的角化過度和角化不全，棘層細(xì)胞增生，真皮淺層纖維化并伴有不等量炎癥細(xì)胞浸潤[1]。目前病因不清，可能與機(jī)體免疫狀況和局部炎性刺激及對其他外來刺激反應(yīng)過度有關(guān)[3]。NOS在人體內(nèi)廣泛分布，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是最集中部位[4]。祝青[5]研究表明IL-12、IFN-γ在外陰白色病變組織中高表達(dá)。李娟等[6]研究表明IFN-γ在外陰鱗狀上皮增生組織中高表達(dá)。IL-1、IL-12、IFN-γ、TNF-α等炎性介子刺激并誘導(dǎo)真皮內(nèi)單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生iNOS。經(jīng)iNOS產(chǎn)生的NO對淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞的趨化性有促進(jìn)作用，有利于炎細(xì)胞的浸潤。因此，在真皮組織中有大量炎細(xì)胞浸潤，可能與NO的趨化作用有一定關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，LSC和外陰正常皮膚的MVD值比較無顯著性差異(P>0.05)，說明LSC病變并沒有引起血管數(shù)目的明顯增多，但iNOS表達(dá)增多，使血管擴(kuò)張、滲透性增加，這一點(diǎn)與LSC真皮組織內(nèi)炎癥的形成相一致。李紅鋼等[7]研究顯示在支氣管黏膜上皮增生和鱗狀化生中有iNOS的表達(dá)，并提示iNOS參與了支氣管黏膜增生和鱗狀化生的炎癥過程。張小艷等[8]研究顯示在幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎中有iNOS的表達(dá)，iNOS促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，加重胃黏膜損傷，促進(jìn)腸上皮化生的形成，甚至異型增生。張麗霞等[9]研究顯示iNOS在肛周尖銳濕疣皮損中高表達(dá)可能促進(jìn)尖銳濕疣細(xì)胞增殖及真皮乳頭血管形成，參與其發(fā)病。本研究在LSC表皮并無iNOS的表達(dá)，而是表達(dá)于真皮淺層，分析在LSC中iNOS與表皮增生可能相關(guān)系，iNOS參與LSC真皮內(nèi)炎癥過程中的血管擴(kuò)張。

在外陰正常皮膚中，無eNOS蛋白表達(dá)；在LSC中，eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)。研究認(rèn)為在炎癥損傷修復(fù)過程中，eNOS在乙酰膽堿作用下由內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放，iNOS又可間接激活eNOS，經(jīng)eNOS產(chǎn)生的NO參與調(diào)節(jié)血壓和器官的血流分布，阻止腎素-血管緊張素的產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，保證血管擴(kuò)張，在血液供應(yīng)上很重要。因此，在LSC中，經(jīng)eNOS產(chǎn)生的NO起到調(diào)節(jié)血流分布、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血管的口徑和流量、增加微循環(huán)通透性的作用，同樣起到加重真皮內(nèi)炎癥反應(yīng)，促上皮細(xì)胞再生的作用。而LSC和外陰正常皮膚的MVD值相比較無顯著性差異(P>0.05)，也提示eNOS參與了SH真皮內(nèi)炎癥過程中的血管擴(kuò)張。

在LS中，iNOS和eNOS蛋白也均有表達(dá)。LS的病理表現(xiàn)為表皮變薄，過度角化及黑素細(xì)胞減少，上皮腳變鈍或消失；上皮下毛細(xì)血管減少，管壁變薄，膠原纖維變性，呈勻質(zhì)帶改變[1]。LS病因不明，目前認(rèn)為是一種自身免疫性疾病，初期免疫增強(qiáng)，破壞真皮內(nèi)微血管，造成局部組織缺氧，膠原纖維變性，加重表皮細(xì)胞的代謝障礙[3]。LS的MVD低于外陰正常皮膚，其值比較有顯著性差異(P<0.05)，證實(shí)了LS真皮組織內(nèi)存在微循環(huán)障礙。這與楊靜等[10]CD34在外陰病變中的研究結(jié)果相一致。iNOS在LS中表達(dá)上調(diào)，提示在微循環(huán)障礙所致的缺血缺氧狀態(tài)下，誘導(dǎo)iNOS的產(chǎn)生，其生成的NO可能有擴(kuò)張血管的作用，從而代償性地改善LS的血液循環(huán)狀態(tài)。iNOS間接激活eNOS，生成的NO也具有擴(kuò)張血管的作用，而在LS中eNOS表達(dá)上調(diào)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。

iNOS和eNOS在LSC中的表達(dá)明顯高于LS，兩者相比較有顯著性差異(P<0.05)，LSC的MVD值也明顯高于LS，兩者比較也有顯著性差異(P<0.05)。說明iNOS和eNOS在LSC中的擴(kuò)張血管作用是增加炎癥的滲出，而在LS中的擴(kuò)張血管作用是增加血管口徑，改善微循環(huán)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在LSC和LS中，iNOS表達(dá)陽性時(shí)eNOS也較多呈陽性表達(dá)，iNOS表達(dá)陰性時(shí)eNOS大部分也為陰性，兩者呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。推測iNOS和eNOS之間可能存在協(xié)同效應(yīng)，共同催化產(chǎn)生NO，參與LSC真皮內(nèi)炎癥過程中的血管擴(kuò)張，在LS真皮中擴(kuò)張血管，代償性地改善LS的血液循環(huán)狀態(tài)。

綜上所述，NOS在LSC和LS中均參與了疾病的發(fā)展過程，因此，以NOS/NO為靶點(diǎn)治療，應(yīng)用NOS抑制劑，可能為LSC和LS的臨床治療開辟新途徑。