姜航，丁劍楠, ，黃葉菁，陳微懿，鄒華, *，史紅星

1. 江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215009；3. 國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點實驗室，北京 102205

塑料以其良好的經(jīng)濟(jì)適用性成為生產(chǎn)生活中必不可少的材料。據(jù)統(tǒng)計，全球塑料年產(chǎn)量已從1950年的 170萬噸增長到 2016年的 3.4億噸（Murphy et al.，2017；Proki? et al.，2019）。與此同時，大量的塑料被丟棄，不可避免地會進(jìn)入土壤和水生態(tài)系統(tǒng)。這些廢塑料經(jīng)過機(jī)械磨損、熱解、水解和生物降解，逐漸降解成直徑小于5 mm的碎片，即所謂的微塑料（Microplastics，MPs）（Law et al.，2014）。海洋環(huán)境中的MPs污染已在世界范圍內(nèi)普遍證實（Eriksen et al.，2014；Andrady et al.，2011）。近期，在淡水環(huán)境中，也報道了MPs的廣泛檢出（Su et al.，2016；Wang et al.，2017；Eerkes-Medrano et al.，2015）。水體中的MPs容易被水生生物誤食或者吸附于生物體表面（Kolandhasamy et al.，2018），通過食物鏈傳遞（Mattsson et al.，2014），進(jìn)而影響水生生物的生理代謝、生長發(fā)育和繁殖等過程（Wright et al.，2013；Mao et al.，2018；Blarer et al.，2016）。

MPs具有比表面積大，疏水性強(qiáng)的特點，極有可能吸附水環(huán)境中的其他污染物，形成復(fù)合污染（Brennecke et al.，2016；Ziccardi et al.，2016）；這也導(dǎo)致風(fēng)險源對水生生物的污染脅迫途徑愈發(fā)復(fù)雜（Savoca et al.，2017），可能會造成不可預(yù)知的生態(tài)風(fēng)險。目前，有關(guān)MPs與水環(huán)境中其他污染物復(fù)合污染的研究剛剛起步，且多集中于和多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等傳統(tǒng)污染物的聯(lián)合效應(yīng)研究（Batel et al.，2016；Sleight et al.，2017；Karami et al.，2016；Oliveira et al.，2013），有關(guān)MPs與其他新興有機(jī)污染物之間的相互作用研究仍然有限。

抗生素是近年來受到較高關(guān)注的一類新興有機(jī)污染物。由于存在濫用現(xiàn)象，抗生素在我國水環(huán)境中的賦存較為廣泛（Liu et al.，2013）。羅紅霉素（Roxithromycin，ROX）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，普遍應(yīng)用于呼吸道，泌尿和軟組織感染等病癥的治療。目前，ROX已在世界范圍內(nèi)的水環(huán)境中廣泛檢出。在意大利北部波河流域某污水廠進(jìn)出水中發(fā)現(xiàn)ROX 的濃度為 65－290 ng·L-1（Verlicchi et al.，2014）；冬季我國湘江水體中ROX的濃度范圍為1.4－190 ng·L-1（Lin et al.，2018）；Kleywegt et al.（2011）甚至在加拿大飲用水中發(fā)現(xiàn)了ROX的賦存（5 ng·L-1）。研究表明，ROX能在水生生物體內(nèi)累積，并對其神經(jīng)、代謝和氧化應(yīng)激等生理生化功能產(chǎn)生影響（Liu et al.，2014；Besseling et al.，2015；Alomar et al.，2017）。然而，水環(huán)境中共存的MPs如何影響 ROX在淡水生物的吸收、分布、累積和代謝等毒理動力學(xué)過程，是否會引發(fā)毒性增敏效應(yīng)，目前還未可知。

浮游生物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量生產(chǎn)和傳遞均有重要作用。然而，目前有關(guān)MPs水生毒理學(xué)的研究多集中于魚類（de Sá et al.，2018），有關(guān)MPs和抗生素復(fù)合污染對浮游生物的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究還較為缺乏。本文以我國淡水水域中常見的浮游植物斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）和浮游動物大型溞（Daphnia magna）作為模式生物，探究MPs和ROX復(fù)合污染對浮游生物的生理生化過程的交互效應(yīng)。研究結(jié)果可為水環(huán)境中新興污染物的生態(tài)風(fēng)險評價和控制提供理論支持，同時可為水體中新興污染物環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)品和試劑

綠色熒光聚苯乙烯（Polystyrene，PS）微球（粒徑為0.1 μm，密度為10 mg·mL-1）購自大鵝（天津）科技有限公司。PS-MPs原液在4 ℃下避光儲存，并在每次使用前進(jìn)行超聲處理。ROX標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）購自上海升德醫(yī)藥科技有限公司，在4 ℃下避光保存，使用甲醇制備母液，并在-20 ℃下保存。

1.2 受試生物

斜生柵藻和大型溞購自中科院水生生物研究所（武漢）。斜生柵藻在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于光照培養(yǎng)箱（GZX-250BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)大繁殖和馴化培養(yǎng)。溫度控制在(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為8000 lux，光暗比為12 h∶12 h。每天定期振蕩3次，每隔1－2周移種，以純化藻種并使其同步生長。

大型溞用超純水配制的重組水進(jìn)行培養(yǎng)，每1000 mL重組水中含有58.5 mg CaCl2·2H2O，24.7 mg MgSO4·7H2O，13.0 mg NaHCO3和 1.2 mg KCl。大型溞置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為 2000 lux，光暗比為 12 h∶12 h。在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)液每周更換 3次，并每天以斜生柵藻對大型溞進(jìn)行喂食，喂食的藻細(xì)胞密度為105cells·mL-1。

1.3 實驗設(shè)置

1.3.1 斜生柵藻暴露實驗

經(jīng)實驗室培養(yǎng)馴化后，將斜生柵藻分別置于250 mL錐形瓶，將熒光PS-MPs和/或ROX原液添加到藻液。暴露處理包括空白對照、PS-MPs單獨暴露（1000 μg·L-1PS-MPs）、ROX 單獨暴露（2.5 μg·L-1ROX）、PS-MPs與 ROX 共同暴露（1000 μg·L-1PS-MPs+2.5 μg·L-1ROX）。每種暴露處理包括 3個平行試驗，初始藻細(xì)胞密度為 1×106cells·mL-1，體積為200 mL。暴露周期為72 h，在暴露的第0、6、12、24、36、48和72小時，測定各暴露組藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量和最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）等生理指標(biāo)。在各時間點用玻璃吸管取暴露液樣品后，對樣品進(jìn)行 10 min的離心（1000×g），離心結(jié)束后，將上清液轉(zhuǎn)移至 15 mL離心管，保存于-80 ℃冰箱中用于測量暴露液中ROX濃度。

1.3.2 大型溞暴露實驗

經(jīng)實驗室培養(yǎng)馴化后，將空腹24 h的成年大型溞分別置于100 mL燒杯中，每杯加入50 mL培養(yǎng)液，將熒光PS-MPs和/或ROX原液添加到大型溞培養(yǎng)液中，制備試驗溶液。暴露處理包括空白對照、PS-MPs單獨暴露（250 μg·L-1PS-MPs）、ROX 單獨暴露（5 μg·L-1ROX）、PS-MPs與 ROX 共同暴露（250 μg·L-1PS-MPs+5 μg·L-1ROX）。每種暴露處理包括3個平行試驗。喂養(yǎng)實驗選取10只大型溞，投加藻細(xì)胞密度為1×106cells·mL-1的斜生柵藻，避光暴露 5 h，測定暴露前后暴露液中斜生柵藻藻細(xì)胞密度，以計算大型溞的牧食率以及濾水率。生物標(biāo)志物實驗選取30－35只大型溞，絕食暴露48 h后，稱重后放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.4 生理生化指標(biāo)檢測

使用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下檢測藻細(xì)胞密度；采用丙酮萃取分光光度法測定藻胞內(nèi)葉綠素 a濃度（戴欣等，2013），再根據(jù)公式：

葉綠素含量(mg·g-1)=葉綠素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重 （1）

計算葉綠素含量（關(guān)愛農(nóng)等，2009）；使用FluorCam封閉式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（FluorCam 800F）測定Fv/Fm。

參考Ding et al.（2015）的方法對樣品中ROX濃度進(jìn)行測定。將各時間點取的暴露液樣品，經(jīng)0.45 μm玻璃纖維過濾器過濾以去除雜質(zhì)，過HLB固相萃取柱純化，以6 mL甲醇洗脫，氮吹至干，最后用甲醇定容至1 mL。采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC/MS/MS）（Waters ACQUITY UPLC Xevo TQ）對ROX進(jìn)行定量分析。在Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）上進(jìn)行層析分離。流動相溶液設(shè)定：A為0.1%甲酸溶液，B為100%乙腈。具體流動相梯度如表 1所示。流速設(shè)置為0.3 mL·min-1。每次樣品進(jìn)樣體積為5 μL。質(zhì)譜檢測的電噴霧電離源（ESI）設(shè)定為正模式。ROX的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)：停留時間 328 ms；母離子質(zhì)荷比為837.50；子離子質(zhì)荷比為158.00；碰撞能量30.0 V；碰撞電壓37.0 V；保留時間1.58 min。外標(biāo)法定量，ROX標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2＞0.99。

表1 流動相梯度變化Table 1 Change in mobile phase for target compound

按照商業(yè)試劑盒（中國蘇州科銘生物科技有限公司）說明書要求測定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）等細(xì)胞水平生物標(biāo)志物。

1.5 數(shù)據(jù)分析

牧食率和濾水率是大型溞喂養(yǎng)實驗的常規(guī)指標(biāo)，常用來驗證外源污染物的富集是否會影響其對食物的攝入。牧食率（I）指某特定時間內(nèi)每只大型溞所消耗的綠藻的藻細(xì)胞個數(shù)，單位為cell·(ind·h)-1；濾水率（F）指一定量水樣中大型溞個體在單位時間內(nèi)濾過的含有一定數(shù)量綠藻的水樣量，單位可表示為μL·(ind·h)-1。濾水率和牧食率的計算公式為：

式中C0和Ct分別表示為起始和終點斜生柵藻的藻細(xì)胞密度（cell·μL-1）；t為試驗時間；n 表示容器中大型溞的個數(shù)；V為試驗水樣體積；Ct′為對照組終點藻細(xì)胞密度；A是指修正系數(shù)。

研究結(jié)果采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，單因素方差分析進(jìn)行差異性檢驗（One-way ANOVA，Duncan檢驗），分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 暴露液中ROX的濃度變化

圖1 72 h暴露期間ROX單獨暴露組和PS-MPs與ROX共同暴露組暴露液中ROX濃度隨時間變化Fig. 1 Temporal change in ROX concentration in media in ROX-alone treatment and PS-MPs+ROX co-treatment during 72 h exposure

如圖1所示，在ROX單獨暴露組中，暴露開始時（0 h），暴露液中ROX的平均濃度為(2.4±1.0)μg·L-1。暴露開始24 h后，暴露液中ROX的濃度顯著降低（P＜0.05），此時 ROX 的平均濃度為(1.5±0.3) μg·L-1；隨后，暴露液中的 ROX 濃度趨于平衡。而在MPs與ROX共同暴露組中，暴露開始時（0 h），ROX 的平均濃度為(2.7±0.4) μg·L-1。暴露開始 24 h后，暴露液中 ROX的濃度顯著降低（P＜0.05），其平均濃度為(1.2±0.3) μg·L-1。暴露 72 h結(jié)束時，單獨暴露組和共同暴露組中 ROX濃度比初始暴露濃度分別下降了76.1%和83.8%。暴露液中 ROX濃度的下降可能是由斜生柵藻細(xì)胞、PS-MPs以及容器器壁的吸附導(dǎo)致（Smets et al.，1990）。Ding et al.（2015）發(fā)現(xiàn)在 20 μg·L-1ROX 暴露下，斜生柵藻會在暴露開始后數(shù)小時內(nèi)迅速吸附富集暴露液中的ROX，且在24－36 h左右達(dá)到富集平衡狀態(tài)，最終暴露液中 ROX濃度僅為初始暴露濃度的44.7%。在本實驗中，暴露6 h后，共同暴露組中ROX的濃度要低于ROX單獨暴露組（圖1），這表明PS-MPs吸附了暴露液中的ROX。MPs具有疏水性，并且能夠通過靜電作用在水中吸附多種抗生素（Li et al.，2018），有學(xué)者甚至發(fā)現(xiàn)MPs能夠?qū)前奉惪股鼗前芳讗哼虍a(chǎn)生不可逆的吸附作用（Razanajatovo et al.，2018）。實際水環(huán)境中，污染物組成更加復(fù)雜，MPs很可能吸附許多不同種類的污染物，并不同程度上改變復(fù)合污染體系中污染物的環(huán)境行為及毒理效應(yīng)，帶來不可預(yù)知的環(huán)境風(fēng)險。因此，有必要深入研究MPs與抗生素等有機(jī)污染物的聯(lián)合生態(tài)效應(yīng)。

2.2 PS-MPs與ROX對斜生柵藻的種群增長影響

如表2和圖2所示，在暴露48 h后，各單獨暴露組中斜生柵藻藻細(xì)胞密度、葉綠素 a含量以及Fv/Fm均已顯著低于空白對照組（P＜0.05）；暴露72 h后，PS-MPs單獨暴露組中斜生柵藻的各項生理指標(biāo)相較于空白實驗組分別下降了9.4%、9.2%、8.6%，這表明PS-MPs對斜生柵藻的生長具有抑制作用，同時對其光合作用效率產(chǎn)生了一定的負(fù)面影響。Besseling et al.（2014）將斜生柵藻連續(xù)72 h暴露于PS-MPs，同樣觀察到PS-MPs抑制了藻類種群生長并降低了藻類的葉綠素a含量，該學(xué)者認(rèn)為納米級PS-MPs會吸附在綠藻細(xì)胞膜表面，減少藻類對CO2的吸收，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)（ROS）的產(chǎn)生，造成了氧化損傷，最終抑制了藻類的生長。Mao et al.（2018）研究了 PS-MPs暴露下，小球藻（Chlorella pyrenoidosa）在整個生長期內(nèi)的生理指標(biāo)變化，結(jié)果顯示 PS-MPs暴露濃度為 10、50和100 mg·L-1時，藻類生長最大抑制率分別為21.0%、29.0%和38.5%，其中100 mg·L-1PS-MPs暴露下，小球藻的Fv/Fm最大抑制率高達(dá)93.5%；該研究者指出附著在藻類上的PS-MPs顆?？梢栽鰪?qiáng)光衰減并降低營養(yǎng)和氣體交換的有效性，從而引起對藻類的生長、呼吸和光合作用的不利影響。在本實驗中，ROX單獨暴露72 h后，斜生柵藻的藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量以及Fv/Fm分別下降了10.2%、7.6%和7.3%。Yang et al.（2008）通過72 h的暴露實驗分析了 12種抗生素對月牙藻（Pseudokirchneriella subcapitata）生長的影響，發(fā)現(xiàn)超過半數(shù)的抗生素對月牙藻的生長產(chǎn)生抑制作用，該研究者認(rèn)為抗生素會結(jié)合亞基50S核糖體，抑制肽的轉(zhuǎn)運和干擾蛋白質(zhì)的合成，從而抑制綠藻的生長。

表2 暴露72 h后不同暴露組中斜生柵藻各項生理指標(biāo)抑制率Table 2 Inhibition rates of different exposure groups on physiological indexes of S. obliquus after exposure for 72 h

圖2 不同暴露處理72 h期間斜生柵藻（A）藻細(xì)胞密度，（B）葉綠素a含量及Fv/Fm（C）的變化Fig. 2 ( A) Algal cell concentration, (B) Chlorophyll-a concentration and(C) Fv/Fm variation of S. obliquus with different exposure treatments during 72 h exposure

MPs和 ROX聯(lián)合暴露對斜生柵藻藻細(xì)胞密度、葉綠素a含量以及Fv/Fm的影響見圖2和表2，隨著暴露時長的增加，在暴露48 h之后，PS-MPs與 ROX共同暴露組中斜生柵藻的各項生理指標(biāo)均顯著低于空白對照組（P＜0.05），PS-MPs與ROX共同暴露組中斜生柵藻的藻細(xì)胞密度相較于空白實驗組下降了13.3%，葉綠素a含量下降了9.5%，F(xiàn)v/Fm下降了 9.3%，但是與各單獨暴露組無顯著性差異（P＞0.05），這意味著PS-MPs與ROX共同暴露對斜生柵藻生長的抑制效果并沒有比二者的單獨暴露更為明顯。Zhu et al.（2019）研究了 4種不同類型的MPs和三氯生（TCS）對中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)由于 TCS的吸附，使得 MPs的疏水性增加，導(dǎo)致MPs在水中沉淀，減少了MPs與微藻細(xì)胞之間的接觸機(jī)會，從而降低了MPs和TCS的毒性。在本實驗，共同暴露組中的PS-MPs對ROX的吸附可能導(dǎo)致二者接觸斜生柵藻藻胞的機(jī)率降低，導(dǎo)致聯(lián)合毒性效應(yīng)并沒有比單一毒性更加顯著。Zhang et al.（2018）研究了氨基修飾的聚苯乙烯納米粒子（nPS-NH2）和草甘膦對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）聯(lián)合毒性的影響，發(fā)現(xiàn)nPS-NH2與草甘膦共暴露對藻類生長的抑制具有拮抗作用；該學(xué)者認(rèn)為，草甘膦對銅綠微囊藻有很強(qiáng)的抑制作用，但由于 nPS-NH2對草甘膦具有很強(qiáng)的吸附能力，顯著減輕了草甘膦對銅綠微囊藻的生長抑制作用。雖然本研究中PS-MPs和ROX的聯(lián)合暴露對斜生柵藻的急性毒性影響并沒有比單一暴露更為顯著，但是自然水環(huán)境中，MPs與抗生素很可能是長期共存的，而它們對浮游植物產(chǎn)生的長期聯(lián)合效應(yīng)還未可知，因此有關(guān)MPs與抗生素的慢性毒性實驗亟待展開。

2.3 PS-MPs與ROX對大型溞的毒理效應(yīng)

如圖 3所示，在本實驗各暴露組中，大型溞的牧食率和濾水率均有明顯的降低，其中，PS-MPs單獨暴露組中大型溞的牧食率和濾水率相較于空白實驗組分別下降了38.1%和39.4%，表明大型溞的覓食行為受到了PS-MPs的顯著抑制。Cole et al.（2013）將15種浮游動物暴露于PS-MPs后，發(fā)現(xiàn)包括大型溞在內(nèi)的 13種浮游動物均具有攝食暴露液中PS-MPs的能力，并且攝入的PS-MPs能夠累積在浮游動物體內(nèi)，導(dǎo)致攝食器官和消化道堵塞，造成能量缺乏，從而抑制其牧食率。在 ROX單獨暴露組中，大型溞的牧食率和濾水率相較于空白實驗組分別下降了58.9%和58.7%，表明ROX同樣抑制了大型溞的覓食行為。Pan et al.（2017）在喹諾酮類抗生素諾氟沙星對大型溞的急性毒性實驗中同樣發(fā)現(xiàn)了覓食行為受到抑制的現(xiàn)象；該研究者認(rèn)為隨著抗生素濃度的增加，機(jī)體為了減少能量損失，適應(yīng)環(huán)境脅迫，選擇減少運動，進(jìn)而導(dǎo)致了牧食率的降低。同樣的，Yan et al.（2019）也發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素磺胺二甲嘧啶能夠影響輪蟲（Brachionus calyciflorus）的神經(jīng)信號傳遞，抑制消化酶活性，最終導(dǎo)致攝食能力的下降。

圖3 不同暴露處理48 h后大型溞（A）牧食率和（B）濾水率變化Fig. 3 (A) Ingestion rates and (B) filtration rates variation of D. magna with different exposure treatments after 48 h exposure

在暴露48 h后，PS-MPs與ROX共同暴露組中大型溞的牧食率和濾水率相較于空白實驗組分別下降了 31.3%和31.6%。在本實驗中，共同暴露組中大型溞的牧食率和濾水率與 PS-MPs單獨暴露組無顯著差異（P＞0.05），但遠(yuǎn)高于 ROX單獨暴露組（P＜0.05），說明 ROX對大型溞覓食行為的抑制效果要強(qiáng)于PS-MPs，但是在二者共存的情況下，PS-MPs能夠降低ROX對大型溞覓食行為的影響。Zhang et al.（2019）研究了PS-MPs和ROX的交互效應(yīng)對紅羅非魚（Oreochromis niloticus）的生理生化影響，觀察到聯(lián)合暴露下的紅羅非魚腦神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶（AChE）活性受抑制程度要明顯小于ROX單獨暴露，這表明PS-MPs存在的情況下，能夠減輕ROX對紅羅非魚的覓食和運動等功能的抑制作用，該研究者認(rèn)為吸附在PS-MPs表面上的ROX不能直接與AChE相互作用，從而減輕抑制作用。Fonte et al.（2016）近期研究了抗生素頭孢氨芐和聚乙烯（Polyethylene，PE）MPs對蝦虎魚（Pomatoschistus microps）的聯(lián)合效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露和PE-MPs單獨暴露96 h后對蝦虎魚捕食性能的影響沒有顯著差異，但是蝦虎魚在聯(lián)合暴露后的捕食性能略高于抗生素單獨暴露后的捕食性能，這表明 PE-MPs的存在降低了頭孢氨芐的毒性；該作者認(rèn)為 PE-MPs可能在生物體內(nèi)發(fā)生改性，使得本要進(jìn)入生物細(xì)胞內(nèi)的頭孢氨芐被 PE-MPs結(jié)合，導(dǎo)致頭孢氨芐的毒性降低。雖然MPs和抗生素復(fù)合污染對水生生物覓食行為的影響機(jī)理目前還不完全清楚，但本實驗研究顯示在環(huán)境相關(guān)濃度的MPs和ROX暴露下，大型溞的攝食能力受到了顯著抑制，這可能會導(dǎo)致機(jī)體缺乏營養(yǎng)供應(yīng)，從而對大型溞的繁殖能力產(chǎn)生抑制作用。

2.4 PS-MPs與ROX對大型溞的生理生化影響

生物體受到某些外源污染物的脅迫時，會引起其體內(nèi) ROS的含量增多。當(dāng) ROS的含量水平超出生物體自身的清除能力時，氧化脅迫隨即出現(xiàn)。作為抗氧化酶，SOD和CAT廣泛存在于動物、植物和微生物中。SOD能夠催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫和氧氣，然后通過CAT作用將過氧化氫分解生成水（Piddington et al.，2001）。CAT通常與 SOD聯(lián)合作用，建立起生物體對ROS脅迫的應(yīng)激防御機(jī)制。在本實驗中，各暴露組大型溞的SOD活性和CAT活性相較于空白實驗組都有較明顯的降低（圖 4）；PS-MPs單獨暴露組和 ROX單獨暴露組中大型溞的 SOD活性相較于空白實驗組分別下降了 26.1%和13.7%，CAT活性分別下降了24.0%和56.0%，這表明MPs與ROX的存在使得大型溞受到污染脅迫，產(chǎn)生了大量 ROS，而大型溞體內(nèi)的抗氧化酶SOD和CAT不足以抵抗污染物引起的氧化脅迫，從而導(dǎo)致氧化損傷。有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)污染脅迫超過一定限度后，將會抑制抗氧化酶的合成，這時，抗氧化酶的清除速率低于ROS產(chǎn)生速率，導(dǎo)致其體內(nèi)積累過量的ROS而受到毒害（Basha et al.，2003），這可能是導(dǎo)致大型溞抗氧化酶活性降低的原因。

圖4 不同暴露處理48 h后大型溞（A）SOD活性和（B）CAT活性的變化Fig. 4 (A) SOD activity and (B) CAT activity variation of D. magna with different exposure treatments after 48 h exposure

在暴露48 h后，PS-MPs與ROX共同暴露組中大型溞的SOD和CAT活性相較于空白實驗組均受到顯著抑制。在PS-MPs與ROX聯(lián)合暴露下，SOD的活性抑制率為 20.8%，高于 ROX單獨暴露的抑制率（13.7%），低于 PS-MPs單獨暴露的抑制率（26.1%），這說明在 PS-MPs（250 μg·L-1）與 ROX（5 μg·L-1）的聯(lián)合作用下，對大型溞SOD活性產(chǎn)生了簡單相加作用；而CAT的活性在PS-MPs與ROX聯(lián)合暴露下的抑制率為 60%，略大于 PS-MPs和ROX單體暴露的抑制率（抑制率分別為 24%和56%），因此我們認(rèn)為在 PS-MPs（250 μg·L-1）與ROX（5 μg·L-1）共同存在的情況下，會對大型溞CAT活性產(chǎn)生輕微的協(xié)同作用。此外，在本實驗中，共同暴露組中大型溞的SOD活性與PS-MPs單獨暴露組和 ROX單獨暴露組均沒有顯著性差異（P＞0.05），這表明二者共同暴露并沒有顯著增加對大型溞的氧化脅迫。Zhang et al.（2019）等將大型溞暴露于的粒徑為 1 μm 的 PS-MPs（100 μg·L-1）和 ROX（10 μg·L-1）后也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合暴露組與單一暴露組中大型溞的SOD活性沒有顯著性差異，并且觀察到了PS-MPs單一暴露或者與ROX聯(lián)合引起的谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）的顯著降低，這表明二者單獨或共存情況下均會對大型溞造成氧化損傷。Fonte et al.（2016）在研究頭孢氨芐與PE-MPs對蝦虎魚的聯(lián)合效應(yīng)時，同樣發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合暴露與PE-MPs單獨暴露對蝦虎魚的脂質(zhì)過氧化損傷（Lipid Peroxidation，LPO）影響沒有顯著差異，該學(xué)者認(rèn)為水中 PE-MPs會在一定程度上減輕頭孢氨芐對蝦虎魚的毒性。此外，有研究者者發(fā)現(xiàn)PS-MPs與 ROX共存能夠顯著降低紅羅非魚肝臟中丙二醛（MDA）含量，該學(xué)者認(rèn)為 PS-MPs可以通過吸附其他污染物減輕對生物體的氧化損害（Zhang et al.，2019）。現(xiàn)階段有關(guān)MPs和抗生素聯(lián)合毒性的研究大多集中于魚類、貽貝等高營養(yǎng)級水生生物，而有關(guān)大型溞等浮游動物的毒性研究卻鮮有報道，本研究結(jié)果顯示在MPs和ROX共存情況下，對大型溞的抗氧化酶活性產(chǎn)生的明顯的抑制作用，但是其中的機(jī)理還尚未明晰，亟待開展深入研究。

3 結(jié)論

本文研究了0.1 μm PS-MPs和ROX對浮游生物斜生柵藻和大型溞的單一與聯(lián)合毒性。結(jié)果表明，MPs和ROX單一與聯(lián)合暴露對斜生柵藻的生長以及光合作用均有明顯的抑制作用，但是二者聯(lián)合毒性并沒有比單一毒性更加顯著；MPs和 ROX單一與聯(lián)合暴露對大型溞的牧食率和濾水率均有明顯的抑制作用，在二者共存的情況下，PS-MPs能夠降低ROX對大型溞覓食行為的影響；MPs與ROX對大型溞的SOD和CAT等抗氧化酶活性有著一定的抑制作用，在二者共存條件下，會對大型溞SOD活性產(chǎn)生相加作用，對CAT活性產(chǎn)生輕微的協(xié)同作用。本研究結(jié)果可為新興污染物在水環(huán)境中聯(lián)合毒性的深入了解提供科學(xué)依據(jù)，同時可為其在水環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險評價和控制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。