張大文，袁麗娟，張莉，向建軍，廖且根，羅林廣，邱素艷

江西省農業(yè)科學院農產品質量安全與標準研究所，江西 南昌 330200

湖泊富營養(yǎng)化引起的藍藻水華暴發(fā)已經成為一個世界性的水環(huán)境問題，近年來呈現出大范圍、高頻次、高生物量的特征（Huisman et al.，2018）。由其中部分水華藍藻產生的一系列生物毒素對水生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的危害已成為水環(huán)境研究的焦點（Buratti et al.，2017）。自然水體最常見、毒性較大的生物毒素為微囊藻毒素（Microcystins，MCs），迄今為止已發(fā)現了100多種MCs的同分異構體（Puddick et al.，2015），其中最常見的是微囊藻毒素-LR（MC-LR）（Buratti et al.，2017）。MC-LR腹腔注射小白鼠的半致死劑量（LD50值）一般在50－60 μg·kg-1體質量（bm）之間，其毒性與化學類有機磷神經毒劑相當（Kuiper-Goodman et al.，1999）。

我國富營養(yǎng)湖泊中藍藻生物量巨大，以大型淡水湖泊為例，據統(tǒng)計，巢湖水華暴發(fā)總藍藻量（干重）可達 50－70萬噸（蔣雪英，2000），滇池中每年可用于資源化的藍藻量（干重）約為5000 t（周婧斐等，2011）。如此巨大資源的利用已經是一個亟待解決的問題。藍藻細胞雖然能產生一系列的生物毒素，但是其營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)價值較高。天然藍藻中有機質達65%以上，藻泥的蛋白質含量達40%，與大豆的蛋白質含量相當，同時具有豐富的氨基酸和維生素，營養(yǎng)價值極高（丁艷華，2008；許玲等，2010；楊蘇等，2006），是優(yōu)質的飼料蛋白源和飼料添加劑。

已有研究表明，MCs能過誘導細胞產生氧化脅迫，并進一步造成細胞損傷，這可能是 MCs的致毒機理的一個重要方面（朱楓等，2010）。為抵抗氧化損傷，機體內會有一個抗氧化系統(tǒng)，這個系統(tǒng)會利用酶或非酶機制來對抗氧化壓力。這個抗氧化系統(tǒng)的酶主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽還原酶（GR）等，而非酶物質主要包括維生素E、維生素E、維生素A、谷胱甘肽（GSH）等（Ming et al.，2012；Prieto et al.，2008）。

然而，目前關于 MCs對動物體的氧化脅迫方面的研究主要集中在魚類和哺乳動物（Li et al.，2010；Li et al.，2003；Mclellan et al.，2017），MCs對家禽毒性效應的研究基本上是一片空白，僅王春雨（2010）在其碩士論文中初步開展了 MCs對鴨的急性和亞慢性毒性研究以及張曉波等（2011）研究了MCs對鴨胚的毒性和半致死劑量。

腎臟是動物體重要的排泄器官，在MCs的清除過程中起著非常重要的作用。本文采用腹腔注射的方式研究MC-LR對崇仁麻雞腎臟氧化損傷的影響，為藍藻在家禽養(yǎng)殖中的飼料化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：MC-LR（純度≥95%，HPLC）購自ZEN-U Biotechnology公司（臺灣），超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽—S轉移酶（GST）、谷胱甘肽（GSH）、考馬斯亮蘭總蛋白和標準蛋白均由南京建成生物工程研究所提供。

儀器：U-3900紫外-可見分光光度計（HITACHI公司，日本）；SH-1000酶標儀（CORONA公司，日本），組織勻漿機；恒溫水浴鍋；CR22N低溫冷凍高速離心機（HITACHI公司，日本）；DW-HL218-86 ℃超低溫冰箱（中科美菱，中國）。

1.2 試驗動物

健康成年崇仁麻雞，由江西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供，平均體質量1.15 kg。

1.3 腹腔注射毒性試驗

選取124日齡的健康崇仁麻雞60只，平均體質量為1.15 kg，平均分為4組，每組15只雞。試驗設置3個MC-LR染毒劑量組以及1個對照組。每個 MC-LR染毒劑量組一次性注射不同劑量的MC-LR。注射劑量的選擇根據本試驗獲得的 LD50值進行設定，分別為20（高劑量組，HD），10（中劑量組，MD），和 5 μg·kg-1bm（低劑量組，LD），注射體積為1 mL左右。對照組（Control）每只雞注射1 mL生理鹽水。試驗期間未發(fā)現雞的死亡。

1.4 雞組織取樣

雞經腹腔注射后，分別于1、3、12、24、48 h進行取樣。每個時間點從對照組和3個染毒組各取出3只雞，解剖取出完整的腎臟，生理鹽水漂洗，除去血液，用濾紙擦干后，稱重，用錫箔紙包裹后現場放入液氮中保存，24 h后放入-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍保存。

1.5 腎臟系數的測定

根據稱量雞只體質量和腎臟質量，計算腎臟系數（KI）。計算公式如下：

式中：KI為腎臟系數，%；kb為腎臟濕質量，kg；bm為雞只體質量，kg。

1.6 分析方法

按照不同酶試劑盒上的方法對腎臟組織進行勻漿以及處理，CAT、GST和GPX采用紫外-可見分光光度計進行測定，SOD、GSH均采用酶標儀進行測定，并用考馬斯亮蘭總蛋白試劑盒和標準蛋白測定組織的蛋白質含量，測試方法為比色法。CAT、SOD、GPX和GST酶活性單位為U·mg-1，GSH的酶活性單位為 μmol·g-1。

1.7 數據處理

運用SPSS 13.0軟件對數據進行統(tǒng)計處理，采用t檢驗分析處理組與對照組之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 MC-LR對腎臟系數的影響

圖1 腹腔注射不同劑量的MC-LR后雞腎臟系數的變化趨勢Fig. 1 Changes of kidney body weight index in chicken injected intraperitoneally with different dose of MC-LR

腹腔注射MC-LR后，雞腎臟系數的變化情況如圖1所示。與對照組相比，試驗組的雞腎臟系數從1 h后就開始呈現上升趨勢。在1 h和3h時，對照組雞腎臟系數為(0.64%±0.13%)和(0.64%±0.02%)，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別為(0.65%±0.04%)和(0.68%±0.07%)、(0.67%±0.01%)和(0.81%±0.22%)、(0.75%±0.03%)和(0.77%±0.04%)，各試驗組與對照組的腎臟系數之間并無統(tǒng)計學上的差異（t=-1.111－-0.151；P=0.348－0.903）；從12 h開始直至試驗結束（48 h），MC-LR染毒組的腎臟系數較對照組顯著上升。12 h時，對照組、低、中和高劑量組腎臟系 數 分 別 為 (0.58%±0.06%)、 (0.83%±0.15%)、(0.79%±0.11%)和(0.80%±0.12%)；24 h時，各組腎臟系 數 分 別 為 (0.61%±0.01%)、 (0.80%±0.16%)、(0.79%±0.11%)和(0.86%±0.05%)；48 h，各組腎臟系數分別為(0.70%±0.07%)、(0.86%±0.09%)、(0.84%±0.06%)和(0.87%±0.04%)；3個時間點各染毒組的腎臟系數均顯著高于對照組（t=-6.687－-3.495；P=0.018－0.036）。

2.2 谷胱甘肽（GSH）含量變化

不同注射劑量下雞腎臟中谷胱甘肽（GSH）的含量隨時間變化如圖2所示。與對照組相比，雞腎臟中GSH含量在1 h時，染毒組有下降趨勢（對照組、低、中和高劑量組GSH含量分別為(6.06±1.11)、(5.05±0.50)、(5.65±0.85)和(5.19±1.21) μmol·g-1），然后從3 h開始出現不同程度的上升（對照組、低、中和高劑量組 GSH 含量分別為(6.49±1.03)、(6.38±0.82)、(6.85±2.81)、(7.18±1.73) μmol·g-1），到48 h時，染毒組略低于對照組（對照組、低、中和 高 劑 量 組 GSH 含 量 分 別 為(8.83±1.06)、(7.10±0.52)、(7.46±3.22)、(8.33±2.29) μmol·g-1），但各染毒組和對照組之間的差異均未達到統(tǒng)計學水平（t=-3.192－1.854；P=0.069－0.921）。

圖2 不同注射劑量下雞腎臟中GSH含量隨時間的變化Fig. 2 Temporal changes of GSH concentrations in kidney of chicken injected intraperitoneally with different dose of MC-LR

2.3 谷胱甘肽轉移酶（GST）活性變化

圖3 不同注射劑量下雞腎臟中GST酶活性隨時間的變化Fig. 3 Temporal variations of GST activity in kidney of chicken injected intraperitoneally with different dose of MC-LR

雞注射MC-LR后，與對照組相比，染毒組雞腎臟中GST酶活性無顯著變化（圖3）。雞腹腔注射MC-LR后1 h時，高劑量組GST酶活性略高于對照組（對照組和高劑量組 GST酶活性分別為(22.04±4.91)和(25.24±5.75) U·mg-1）；3 h 時，3 個劑量組GST酶活性均高于對照組（對照組、低、中和高劑量組 GST酶活性分別為(23.11±1.34)、(24.97±2.64)、(23.39±3.33)和(27.44±5.35) U·mg-1），但未達到統(tǒng)計學上的差異（t=-0.892－-0.110；P=0.363－0.927）；12 h時，3個染毒組的GST酶活性呈現隨著劑量增加而下降的趨勢（低、中和高劑 量 組 GST 酶 活 性 分 別 為(35.51±3.82)、(32.31±3.80)和(21.81±5.78) U·mg-1），但與對照組(28.22±0.90)之間均未有顯著差異（t=-2.630－2.220；P=0.113－0.361）；24 h時，對照組和低、中、高3個染毒組之間的GST酶活性相當（值分別為 (22.53±5.31)、 (24.44±3.60)、 (23.34±1.56)和(21.82±0.33) U·mg-1）；至 48 h，3 個染毒組 GST酶活性（低、中、高劑量組 GST酶活性分別為(27.02.±1.37)、(26.66±5.69)和(26.25±0.66) U·mg-1）高于對照組(21.30±3.27) U·mg-1，但均未達到顯著水平（t=-2.342－-1.171；P=0.136－0.224）。

2.4 谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性變化

圖4 不同注射劑量下雞腎臟中GPX酶活性隨時間的變化Fig. 4 Temporal variations of GPX activity in kidney of chicken injected intraperitoneally with different dose of MC-LR

不同注射劑量下雞腎臟中谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）的活性隨時間變化如圖4所示。1 h、3 h和 12 h時，低劑量組 GPX酶活性（值分別為(15.68±2.48)、(16.88±0.89)和(17.37±1.80) U·mg-1）與對照組（值分別為(15.33±0.16)、(17.92±0.66)和(17.99±4.91) U·mg-1）相當，24 h (21.17±3.53) U·mg-1和48 h (18.22±4.34) U·mg-1時高于對照組（分別為(16.33±0.83) U·mg-1和(17.35±0.74) U·mg-1）；中劑量組GPX酶活性在1 h (15.51±1.49) U·mg-1和48 h(17.41±1.52) U·mg-1時與對照組相當，其它時間點GPX酶活性（3、12和24 h時分別為(20.40±1.94)、(21.07±1.9)5 和(18.50±1.82) U·mg-1）均高于對照組；高劑量組GPX酶活性在1 h (17.20±1.82) U·mg-1和3 h (19.88±3.37) U·mg-1時高于對照組，其它時間點GPX酶活性（12、24和48 h分別為(16.32±0.92)、(15.67±1.17)、(15.63±0.53) U·mg-1）低于對照組。除了24 h低劑量組的雞腎臟中GPX酶活性顯著高于對照組之外（t=-3.265；P=0.031），其它組別和時間點中的腎臟中 GPX酶活性與對照組之間無統(tǒng)計學上的差異（t=-2.156－1.810；P=0.097－0.918）。

2.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性變化

雞注射MC-LR后，雞腎臟中SOD酶活性的變化情況如圖5所示。SOD酶活性除了3 h時的低劑量 組 (129.94±12.28) U·mg-1和 中 劑 量 組(117.47±2.00) U·mg-1低于對照組(133.15±20.90)U·mg-1外，其它各組SOD酶活性（127.15－169.65 U·mg-1）均高于對照組（121.70－149.16 U·mg-1），但所有染毒組別腎臟中 SOD酶活性與對照組之間的差異均未達到統(tǒng)計學上的顯著水平（t=-5.761－1.058；P=0.056－0.837）。

圖5 不同注射劑量下雞腎臟中SOD酶活性隨時間的變化Fig. 5 Temporal variations of SOD activity in kidney of chicken injected intraperitoneally with different dose of MC-LR

2.6 過氧化氫酶（CAT）活性變化

圖6 不同注射劑量下雞腎臟中CAT酶活性隨時間的變化Fig. 6 Temporal changes of CAT activity in kidney of chicken injected intraperitoneally with different dose of MC-LR

不同注射劑量下雞腎臟中過氧化氫酶（CAT）的活性隨時間變化如圖6所示。除了3 h，低、中和高劑量3個染毒組腎臟中CAT酶活性（值分別為 (116.64±4.29) 、 (96.66±1.13) 、 (74.01±11.20)U·mg-1）低于對照組(123.58±11.33) U·mg-1，且中劑量和高劑量組 CAT酶活性與對照組的差異達到了顯著水平（t=4.253；P=0.024和t=4.432；P=0.022）外，其它時間點，染毒組（104.70－125.70 U·mg-1）與對照組（113.55－123.58 U·mg-1）的CAT酶活性無明顯差異（t=-1.777－2.950；P=0.112－0.913）。

3 討論

3.1 MC-LR對雞腎臟抗氧化酶系統(tǒng)的影響

已有的研究證實，MC-LR能促進腎臟的生理和病理的變化（Nobre et al.，2003），而腎臟也參與了機體對 MCs的清除排泄。因此，腎臟抗氧化系統(tǒng)的功能可能會受到 MCs的影響。生物體中的抗氧化系統(tǒng)包括酶和非酶物質?？寡趸锩钢饕蠸OD、CAT、GPX等，而非酶物質主要包括維生素E、維生素E、維生素A、GSH等（Amado et al.，2010；Lushchak，2011；Yuan et al.，2016）。

抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生作用首先是引 GSH系統(tǒng)的反應，GSH直接參與氧自由基（ROS）的清除及MCs的解毒（Goncalves-Soares et al.，2012），GSH與MCs在GST的催化下形成極性較強的結合產物而易于排出體外，被認為 MCs在動物體內解毒的第一步（Kondo et al.，1992；Pflugmacher et al.，1998）。在本研究中，不同染毒組雞腎臟中 GSH含量與對照組之間無顯著差異，這可能是雞腎臟中GSH的重新合成和/或谷胱甘肽還原酶（GR）將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為GSH補充了其消耗。眾所周知，細胞內 GSH的合成與消耗處于一種動態(tài)平衡。首先，GSH與進入體內異物的結合或在GPX特異性的催化下與ROS的反應消耗，接著機體會從新合成GSH或GR催化將GSSG還原為GSH補充消耗，從而保持體內 GSH水平的平衡。不同動物以及同一動物不同組織中GSH對MCs的響應存在較大差異。譬如，Gehringer et al.（2004）研究發(fā)現，小鼠暴露于MCs后，會引起小鼠肝臟中GSH含量水平的上升；鰱魚暴露于自然水體的藍藻水華（Blaha et al.，2004）以及淡水螺（Radix swinhoei）經MC-LR染毒后（Zhang et al.，2016）也得出了相同的研究結果；而培養(yǎng)的鯉魚肝細胞（Li et al.，2003）、金魚肝臟（Malbrouck et al.，2004）、小龍蝦（Yuan et al.，2016）暴露于MCs時導致了GSH含量的下降；鳙魚腹腔注射含有 MCs的藍藻提取物后，肝臟中 GSH含量水平在整個試驗過程中保持穩(wěn)定（Li et al.，2003），其它作者對丁鯛魚（Tinca tinca）（Atencio et al.，2008）和金魚（Carassius auratus）（Malbrouck et al.，2004）經 MCs染毒后的研究發(fā)現，肝臟中 GSH含量沒有明顯變化。巴西的 Brycon amazonicus 魚腹腔注射 100 μg·kg-1的MC-LR 48 h后，肝臟中GSH含量沒有顯著變化，而鰓中GSH含量相對于對照組下降了43%（Martins et al.，2017）。

GST在MCs的解毒過程中起著非常重要的作用，其催化GSH與MCs結合（Pflugmacher et al.，1998），但是，不同動物試驗、不同器官中 GST酶活性對MCs的響應存在較大差異（Best et al.，2002；Cazenave et al.，2006；Malbrouck et al.，2004；Martins et al.，2017；Wiegand et al.，2005；Yuan et al.，2016；Li et al.，2003）。譬如，Yuan et al.（2016）對小龍蝦暴露于MC-LR的研究指出，小龍蝦肝臟中GST酶活性隨著暴露時間的增加呈現上升趨勢，在斑馬魚早期發(fā)育期的研究中也得出了相似的研究結論（Wiegand et al.，2005）；而當斑馬魚胚胎暴露于 0.5 μg·L-1的 MC-LR和藍藻脂多糖混合物時，GST酶活性受到了抑制（Best et al.，2002），鯰魚（Corydoras paleatus）的MC-RR暴露試驗也得出了類似的研究結果（Cazenave et al.，2006）；巴西的Brycon amazonicus 魚經MC-LR染毒后，其肝臟中GST酶活性顯著上升，而腮中GST酶活性顯著下降（Martins et al.，2017）；Li et al.（2003）等對鳙魚的藍藻提取物的腹腔注射試驗結果顯示，其肝臟中GST呈現先上升后下降的趨勢；金魚幼魚暴露于MC-LR 96 h時，GST酶活性在整個試驗期間未發(fā)生顯著改變（Malbrouck et al.，2004）。在本研究中，與對照組相比，3個染毒組雞腎臟中GST酶活性在整個試驗期間無顯著變化。

已有的研究結果顯示，SOD、CAT和GPX等酶在機體清除過量 ROS中起著非常重要的作用（Amado et al.，2010；Lushchak，2011)，但是，這3種酶活性的變化會隨著MCs的種類、物種類別、劑量以及處理時間的不同而存在較大差異，其變化曲線可能是多階段的（Li et al.，2003；Li et al.，2010；Moreno et al.，2005；Prieto et al.，2006，2007）。譬如，Li et al.（2003）研究結果顯示，MC-LR處理培養(yǎng)的鯉魚肝細胞后，CAT、SOD和GPX酶的活性隨著處理時間的延長而逐漸升高；大鼠經腹腔注射MC-LR，其肝臟和腎臟中CAT、SOD和GPX酶的活性顯著降低（Moreno et al.，2005）；羅非魚腹腔注射含MCs的藍藻提取物后，腎臟中的CAT、SOD 和 GPX 酶的活性顯著降低（Prieto et al.，2007）；鳙魚腹腔注射藍藻粗提物后，其肝臟中SOD、CAT和GPX酶活性均呈現先上升后下降的趨勢（Li et al.，2010）；羅非魚分別用 500 μg·kg-1MC-LR 和 500 μg·kg-1腹腔注射后，MC-LR 處理組肝臟、腎臟和鰓組織中的 SOD酶活性顯著上升，而MC-RR處理組僅腎臟中SOD酶顯著增加，而腎臟和鰓中未見明顯改變；MC-LR和MC-RR處理的羅非魚肝臟、腎臟和鰓中CAT酶活性均顯著上升；肝臟和鰓中 GPX酶活性在兩種毒素處理過程中均無明顯變化，而MC-LR染毒引起了腎臟GPX酶活性的顯著上升，MC-RR染毒未發(fā)生顯著變化（Prieto et al.，2006）。在本研究中，雞腎臟各染毒組中SOD酶活性均略高于對照組，但未達到統(tǒng)計學差異水平，這說明SOD酶參與了腎臟中過量ROS的清除；除3 h時，中、高劑量組雞腎臟中CAT酶活性明顯下降，其它時間點，染毒組與對照組 CAT酶活性無明顯差異，這說明雞腎臟中CAT酶活性在3 h時受到了抑制，同時也參與 ROS的清除；雞腎臟中GPX酶活性在整個試驗期間無明顯變化，對照組與染毒組之間酶活性差異不顯著。

3.2 MC-LR對雞腎臟系數的影響

臟器系數變化是毒理學試驗中較為敏感的指標（Zenick et al.，1989）。在本研究中，雞腎臟系數從 1 h就開始呈現毒素處理組高于對照組的趨勢，并在12 h之后直至48 h，染毒組的腎臟系數顯著高于對照組。這說明，MC-LR注射后導致了雞腎臟充血、腫脹等生理學反應，使腎臟質量增加。這一結果與李哲等（2010）及楊黎江等（2013）對大鼠肝臟和王春雨（2010）對鴨肝臟的研究結果一致。在本研究中，腎臟抗氧化酶系統(tǒng)CAT、GST、SOD和 GPX酶活性以及 GSH含量存在一定程度的變化，雖然未達到統(tǒng)計學上的顯著性水平，這說明，在MC-LR作用下，雞腎臟產生了氧化應激現象，但其抗氧化酶系統(tǒng)可能難以抵御MC-LR危害。

4 結論

（1）在MC-LR作用下，腎臟系數從1 h就開始呈現毒素處理組高于對照組，并在12、24和48 h時，毒素處理組腎臟系數顯著高于對照組的趨勢。

（2）在 MC-LR的作用下，抗氧化酶系統(tǒng)中，除中劑量和高劑量組CAT在3 h時酶活性受到明顯的抑制外，GSH含量和GST、SOD和GPX酶活性在整個試驗期間沒有明顯的變化。

（3）在 MC-LR作用下，雞腎臟產生了氧化應激現象，但是其抗氧化酶系統(tǒng)可能難以抵御MC-LR危害。