王 榮，楊 寬，陳春妮，趙雪儒，袁啟恒，秦 蓓

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021)

亞麻是一種重要的油料作物[1]。亞麻木酚素(Flax lignan)是從亞麻籽中提取的一種生物活性成分，是亞麻籽進(jìn)行深加工和綜合利用的主要成分。亞麻木酚素在哺乳動物腸道微生物的作用下，生成腸二醇和腸內(nèi)酯，呈現(xiàn)出弱的雌激素和抗雌激素效應(yīng)[2]。此外，亞麻木酚素還具有與雌激素活性無關(guān)的藥理活性[3]，如預(yù)防動脈粥樣硬化[4-5]、抗氧化[6]、抗癌[7]等。

近年研究顯示，氧化應(yīng)激參與了心血管疾病、腫瘤、炎癥等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，是此類疾病的發(fā)病機(jī)制之一[8-9]。自由基誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激，而抗氧化劑能清除體內(nèi)產(chǎn)生的過多自由基，且一直是研究的熱點(diǎn)[10]。已有文獻(xiàn)報道，亞麻木酚素具有清除自由基的作用[11]，能提高正常小鼠抗氧化酶的活性[6]。為進(jìn)一步探討亞麻木酚素的抗氧化作用，本文分別建立了紅細(xì)胞和肝組織氧化損傷模型，研究亞麻木酚素對紅細(xì)胞溶血率、血紅蛋白氧化率的影響，研究其對不同模型中MDA含量和主要抗氧化酶活性的影響，為亞麻木酚素作為抗氧化劑的深度應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠，雄性，體重200～300 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：室溫(18～20℃)，濕度50%～70%，自然光照，動物顆粒飼料喂養(yǎng)并自由飲水。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑

亞麻木酚素(CAS No. 148244-82-0，含量98.2%)，上海源葉生物科技有限公司。1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，上海思域化工科技有限公司；2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；過氧化氫酶(CAT)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)，南京建成生物工程研究所；二甲基亞砜(DMSO)、乙醇等均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

自動全波長酶標(biāo)儀、低溫保存冰箱和高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；分析天平；恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻木酚素對DPPH自由基清除率的測定

精密稱取適量亞麻木酚素加水溶解，采用半數(shù)稀釋法制備系列質(zhì)量濃度(5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.078 125 mg/mL)的亞麻木酚素溶液。將100 μL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液置于96孔板中，加入100 μL上述不同質(zhì)量濃度的待測樣品，振搖均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度，每個樣品設(shè)置3個副孔，按下式計算樣品對DPPH自由基的清除率。

式中：Di為待測樣品與DPPH反應(yīng)液在517 nm處的吸光度；D0為DPPH溶液在517 nm處的吸光度；Dj為待測樣品在517 nm處的吸光度。

1.2.2 大鼠紅細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 AAPH氧化損傷大鼠紅細(xì)胞模型及分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的大鼠，腹主動脈采血，4℃下、抗凝全血3 500 r/min離心5 min分離紅細(xì)胞，取紅細(xì)胞沉淀，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)清洗3次，離心，取紅細(xì)胞沉淀加適量PBS搖勻稀釋，制成體積分?jǐn)?shù)為10%的大鼠紅細(xì)胞懸浮液。在96孔板中，每孔加入100 μL紅細(xì)胞懸浮液，給藥組加入50 μL不同濃度的亞麻木酚素溶液，空白組和模型組分別加入50 μL PBS，各組37℃下預(yù)培養(yǎng)30 min，之后給藥組和模型組再加入100 μL 200 mmol/L的AAPH溶液，空白組加入同體積的PBS，繼續(xù)置于37℃下氧化損傷1～4 h，獲得正常組、模型組和給藥組的紅細(xì)胞反應(yīng)液。

1.2.2.2 溶血率的測定

取1.2.2.1制備的紅細(xì)胞反應(yīng)液，用1 mL PBS稀釋，4℃、3 500 r/min下離心5 min，上清液在540 nm處測定吸光度(APBS)。為使紅細(xì)胞完全裂解，取紅細(xì)胞反應(yīng)液，加入1 mL預(yù)冷的雙蒸水，離心，540 nm處測定吸光度(Awater)，計算溶血率。溶血率=APBS/Awater×100%。

1.2.2.3 血紅蛋白氧化率的測定

取1.2.2.1制備大鼠紅細(xì)胞反應(yīng)液，每孔加入100 μL預(yù)冷的雙蒸水，4℃、3 500 r/min下離心5 min，取200 μL上清至96孔板中，分別在630 nm和700 nm處測定吸光度，記為A630和A700。之后各孔再加入10 μL 5%鐵氰化鉀溶液，分別在630 nm和700 nm處測定加入鐵氰化鉀后上清液的吸光度，記為AmetHB630和AmetHB700。計算血紅蛋白氧化率。血紅蛋白氧化率=(A630-A700)/(AmetHB630-AmetHB700)×100%。

1.2.2.4 紅細(xì)胞內(nèi)MDA含量及抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)酶活的測定

取1.2.2.1制備大鼠紅細(xì)胞反應(yīng)液，向反應(yīng)液中加入100 μL預(yù)冷的雙蒸水使紅細(xì)胞完全裂解，4℃、3 500 r/min下離心5 min，棄去上清液，沉淀用PBS清洗3次，每次清洗均在4℃、3 500 r/min下離心5 min，吸取最后一次離心分離的沉淀10 μL，加990 μL預(yù)冷的雙蒸水使總體積至1 mL，-80℃保存?zhèn)溆?。紅細(xì)胞內(nèi)MDA含量以及CAT、SOD、GSH-Px酶活按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.3 大鼠肝組織氧化損傷實(shí)驗(yàn)

取適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的大鼠的肝臟，用冷生理鹽水沖洗，稱重，剪碎，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴中勻漿制成體積分?jǐn)?shù)10%的肝組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在離心管中加入100 μL 10%肝組織勻漿液，給藥組加入50 μL不同濃度的亞麻木酚素溶液，正常組和模型組各加入50 μL PBS，37℃預(yù)培養(yǎng)30 min，給藥組和模型組再加入100 μL 200 mmol/L的AAPH溶液，正常組加入50 μL PBS，繼續(xù)于37℃下孵育不同時間(1～4 h)。然后按照試劑盒說明書分別測定正常組、模型組和給藥組的肝組織勻漿液中MDA含量和CAT、SOD、GSH-Px酶活。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用Oneway-ANOVA 中的Dunnett雙側(cè)t檢驗(yàn)，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞麻木酚素對DPPH自由基的清除能力(見圖1)

由圖1可見，亞麻木酚素對DPPH自由基有一定清除作用，且在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。隨著亞麻木酚素質(zhì)量濃度的增大，DPPH自由基的清除率逐漸提高，當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.312 5 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率約為48.6%，亞麻木酚素對DPPH自由基的清除能力低于陽性對照VC。

圖1 亞麻木酚素對DPPH自由基的清除率

2.2 亞麻木酚素對AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

紅細(xì)胞是進(jìn)行抗氧化損傷研究的最佳細(xì)胞模型。AAPH作為自由基引發(fā)劑，可在37℃下降解生成過氧自由基，該自由基與氧發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成更多種類的自由基，引起細(xì)胞損傷[12]。AAPH誘導(dǎo)氧化應(yīng)激造成的過多活性氧(ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)遭到破壞。紅細(xì)胞氧化損傷可引起細(xì)胞中血紅蛋白氧化生成高鐵血紅蛋白，高鐵血紅蛋白可反映細(xì)胞中蛋白氧化的程度。以溶血率和血紅蛋白氧化率為指標(biāo)，研究了亞麻木酚素對氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果如圖2所示。

注：#表示模型組與正常組相比P<0.05，##表示模型組與正常組相比P<0.01；*表示與模型組相比P<0.05，**表示與模型組相比P<0.01。下同。

圖2 亞麻木酚素對氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用

由圖2可見，正常組紅細(xì)胞溶血率基本恒定，紅細(xì)胞經(jīng)AAPH損傷后，紅細(xì)胞溶血率逐漸增大，4 h模型組紅細(xì)胞溶血率達(dá)到75.39%，與正常組比較具有極顯著差異(P<0.01)。200 mmol/L AAPH孵育4 h時，不同濃度的亞麻木酚素保護(hù)下AAPH誘導(dǎo)的氧化溶血受到不同程度的抑制，且藥物濃度與溶血抑制程度呈現(xiàn)正相關(guān)。另外，與正常組相比，紅細(xì)胞經(jīng)AAPH氧化損傷后，紅細(xì)胞內(nèi)高鐵血紅蛋白增多，4 h時血紅蛋白氧化率為42.9%，隨著亞麻木酚素濃度的增加，血紅蛋白氧化率逐漸降低，特別是亞麻木酚素濃度分別為50、100 μmol/L時對紅細(xì)胞氧化損傷4 h所致的血紅蛋白氧化的保護(hù)作用顯著(P<0.05，P<0.01)。

2.3 亞麻木酚素對紅細(xì)胞MDA和抗氧化酶的影響

AAPH誘導(dǎo)的過氧化反應(yīng)產(chǎn)生ROS，ROS可引起細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，上調(diào)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平，MDA常被認(rèn)為細(xì)胞氧化損傷的標(biāo)志物。CAT、SOD和GSH-Px在細(xì)胞抗氧化的過程中發(fā)揮了重要作用。研究了亞麻木酚素對氧化損傷紅細(xì)胞內(nèi)MDA含量及CAT、SOD、GSH-Px酶活的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 亞麻木酚素對氧化損傷紅細(xì)胞內(nèi)MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px酶活的影響

由圖3可見，AAPH損傷后，紅細(xì)胞內(nèi)MDA含量約為12 nmol/mL，超過正常組20倍以上，100 μmol/L和150 μmol/L亞麻木酚素可顯著降低AAPH氧化損傷4 h的紅細(xì)胞中MDA含量。與正常組相比，模型組SOD、CAT和GSH-Px酶活隨著AAPH孵育時間的延長而降低，AAPH孵育4 h時模型組的酶活與正常組相比具有極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，150 μmol/L亞麻木酚素在不同的孵育時間(2 h和4 h)均提高了SOD和CAT的酶活，100 μmol/L和150 μmol/L亞麻木酚素提高了AAPH氧化損傷4 h時的GSH-Px的酶活，其作用呈劑量依賴性。

2.4 亞麻木酚素對肝組織MDA和抗氧化酶的影響

MDA是過氧化脂質(zhì)分解的最終產(chǎn)物，被認(rèn)為是常見的氧化應(yīng)激標(biāo)志物[13]。機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)由非酶系統(tǒng)和酶系統(tǒng)共同構(gòu)成，其抗氧化酶系統(tǒng)主要包括CAT、SOD、GSH-Px等[14]。研究了亞麻木酚素對AAPH誘導(dǎo)氧化損傷的肝組織中MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px酶活的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 亞麻木酚素對氧化損傷肝組織MDA含量及SOD、CAT和GSH-Px酶活的影響

由圖4可見，與正常組相比，AAPH增加了肝組織中MDA的含量，隨著孵育時間的延長，模型組MDA的含量逐漸降低。說明AAPH損傷后在短時間內(nèi)引起了脂質(zhì)過氧化，但隨作用時間延長，與抗氧化系統(tǒng)逐漸達(dá)到平衡，MDA含量降低。與模型組相比，150 μmol/L亞麻木酚素在不同孵育時間均能顯著降低肝組織中MDA的含量(P<0.05)。與正常組相比，且隨著孵育時間的延長，模型組SOD和CAT酶活逐漸降低，說明AAPH使肝組織中的抗氧化酶系失衡，隨著孵育時間的延長，酶活逐漸降低，也說明抗氧化酶系的變化是一個緩慢的過程。AAPH作用4 h時，SOD、CAT和GSH-Px酶活最低，而150 μmol/L亞麻木酚素在孵育時間為4 h時顯著提高了SOD的酶活。AAPH作用4 h時，亞麻木酚素3個劑量組均能顯著增強(qiáng)CAT的酶活。AAPH增加了大鼠肝組織中GSH-Px的酶活，但亞麻木酚素的加入并未影響AAPH增加的GSH-Px酶活。

3 結(jié) 論

本文建立了AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞和肝組織損傷模型，研究了亞麻木酚素的抗氧化作用。結(jié)果顯示：亞麻木酚素對DPPH自由基具有良好的清除作用，在一定范圍內(nèi)其作用呈現(xiàn)濃度依賴性；與AAPH模型組相比，在一定濃度范圍內(nèi)亞麻木酚素能夠顯著抑制AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血和血紅蛋白氧化，其作用可能是通過保護(hù)紅細(xì)胞和肝組織內(nèi)抗氧化酶系(SOD、CAT和GSH-Px)和抑制脂質(zhì)過氧化實(shí)現(xiàn)的。